二、SDS-PAGE结合免疫印迹法检测Apo（a）表型

检测Apo（a）表型的方法中，以Utermann法或其改良法最为常用。这类方法先用SDS-PAGE分离Apo（a）异构体，然后用特异的多克隆或单克隆抗体作免疫印迹显示。 1．仪器与试剂 电泳仪，夹心式垂直板电泳槽及凝胶转移电泳槽，NC膜（孔径0.45μm,转移电泳用）；高分子量系列蛋白标准（MW67000～669000，Pharmacia产品）；ApoB100纯品；主要试剂有：①30%丙烯酰胺贮存液；②电泳缓冲液为pH8.3，内含0.1%SDS的0.025mol/lTris-0.192mol/L甘氨酸溶液；③转移电泳缓冲液为pH8.3，内含20%甲醇的0.02mol/lTris～0.15mol/L甘氨酸溶液；④样品处理缓冲液：50g/l SDS水溶液4ml，β-疏基乙醇800μl，750ml/L甘油溶液800μl，10g/L溴酚蓝溶液200μl混合；⑤洗涤缓冲液为pH7.4内含9g/L的0.01mol/lTris-HCl溶液；⑥封闭液为内含50g/L去脂奶粉（或含10g/L小牛血清白蛋白）的洗涤缓冲液；⑦第一抗体为羊抗人Apo（a）血清；⑧第二抗体作为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG；⑨底物溶液为脂溶性4-氯-1-萘酚底物液或水溶性二氨基联苯胺（DAB）底物液。 2．实验方法 ①凝胶板制备：按照说明书安装好垂直板电泳槽，参照Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分离胶和3.6%浓缩胶制备胶板；②电泳：血清样品18μl与100μl新鲜配制样品处理缓冲液混匀，置100℃水浴10min，冷却，取此混合物20μl加入样品槽中并覆以电泳缓冲液，ApoB100与高分子量蛋白标准处理，除不加β-巯基乙醇其他操作同前。在上下槽注入电泳缓冲液，接通电源（上槽按负极，下槽接正极）待溴酚蓝跑出凝胶下沿2h即可结束电泳（通常120V电泳6h）；③转移电泳：取此凝胶，切下分子量蛋白带放入SDS洗脱液中过夜，以固定凝胶大小并洗脱掉未与蛋白结合的SDS，0.01%考马斯亮蓝G-250染色室温1h，7%乙酸脱去背景颜色。剩余凝胶铺在已浸过转移电泳缓冲液的NC膜上，在凝胶NC膜外再覆以3mm厚的滤纸（预先用转移电泳缓冲浸湿），将此滤纸/凝胶/NC膜/滤纸一同放在电泳转移支架上，按层次相夹置于装满转移电泳缓冲液的电泳槽中，接通电源（凝胶面对负构，NC膜面对正极）。120V电泳6h（30℃以下）或4℃30V转移过夜；④免疫印迹分析：取出转移后的NC膜在洗涤液中洗3次后，置封闭液中室温封闭3h（或37℃1h），在洗涤液中洗3次，加入1：100稀释的第一抗体并充分混匀，37℃温浴6h（或过夜），随后用洗涤液洗5次（10min×5）甩干。加入1：500稀释的第二抗体，混匀，37℃作用2h，洗涤同上。加入新配制的底物溶液于室温下摇动直至出现紫色（或紫褐色）并看到背景（1～5min）时用蒸馏水冲洗终止反应，空气干燥封于塑料袋中避光保存；⑤Apo（a）表型判定：量出Apo（a）蛋白带中心距分离胶界面的距离，对照ApoB100和高分子量标准的泳动距离，确定Apo（a）带型及各表型的分子量范围。在SDS-PAGE中蛋白质的迁移速度主要取决于它的分子量大小而与其形态及所带电荷多少无关。用巯基乙醇打开Apo（a）与ApoB100之间的二硫键，Apo（a）的分子量即可通过与蛋白标准比较相对迁移率的办法而求得。并按其与ApoB100在凝胶中迁移速率的快慢而将其分为F（较ApoB100快），B（与ApoB100相似），S1、S2、S3、S4（依次较ApoB100慢）6种多态异构体并组合成各种Apo（a）表型，见图19-1所示。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua150.jpg[alt]几种Apo（a）表型的免疫印迹分析示意图谱[/alt][/img] 图19-1 几种Apo（a）表型的免疫印迹分析示意图谱 3．实验条件的优化 在此方法中，聚丙烯酰胺凝胶起着载体和分子筛的双重作用，不同浓度的凝胶适于不同分子量的蛋白质分离，国外用于Apo（a）表型测定的凝胶浓度差异较大（3.25%～7.5%）,经过对此实验发现，分离胶选用6.6%较为适宜，其操作方便，分离效果也较好。分离和转移电泳都会因产热而影响实验效果。而国产电泳槽冷却装置效果较差。为解决这一矛盾，除选用诸如Bio-Rad产垂直板电泳槽及转印槽（Model 220 dualvertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell；Bio-Rad Labs；Richmond,CA）外，可采取降低电压延长电泳时间和4℃环境中电泳的措施，也可取得较好效果，免疫印迹反应中也可选用鼠抗人Apo（a）单克隆抗体作为一抗，用酶标兔抗鼠IgG作为二抗。应用酶标抗体反应作为二抗时，底物以脂溶性4-氯-1-萘酚或联茴香胺较水溶性DAB溶液为好，也可用金标、I125标抗体作为二抗，通过银染或放射自显影技术显示Apo（a）蛋白区带，但此类方法已较少使用。将生物素标记的抗体作为二抗，通过生物素-亲和素系统放大信号，可大大提高检测敏感性。血清标记贮于4℃一周或贮存于-80℃一年内仍可检出Apo（a）遗传表型。Kamboh等介绍的方法多采用标准蛋白分子量定型法确定Apo（a）异构体。Sandholzer等报道，Apo（a）6种异构体分子量分别为F：＜400000，S1≈520000，S2≈580000，S3≈640000，S4＞700000，国外现已有Apo（a）表型测定标准物（含异构体F、S1～S3-ImmunoAG、Austria），可用于Apo（a）异构体判定及质控。分子量标准除采用凝胶染色外，也可将分子量标准蛋白转移电泳至NC膜上，切下非特异性转移带（即标准部分）用低浓度CBBG-250或氨基黑10B染色法染色，并记下标准的位置。