一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

[b]（一）原理[/b] 以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。 [b]（二）试剂与仪器[/b] 1．试剂 （1）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。 （2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g，混匀。 （3）0.35%过硫酸铵（AP） （4）四甲基乙二胺（TEMED） （5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。 （6）浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。 （7）0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。 （8）电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。 （9）1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。 （10）40%蔗糖水溶液。 2．仪器 电泳仪、光密度扫描仪 [b]（三）操作[/b] 1．制胶 （1）先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。 （2）配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。 （3）浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。 2．血清预染与加样 在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。 3．电泳 将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。 4．剥胶 从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。 电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。 5．定量 浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。