二、对比免疫荧光染色

1．染色特点 （1）要进行SC和IgA组织定位，必须有相应特异抗血清。SC抗血清国内没有生产。国内商品IgA抗血清的抗原多来自人乳中的SIgA，具有双重抗原性（SC和IgA），不能特异进行IgA组织定位，最好采用抗人α-重链抗血清。 （2）SC是糖蛋白，IgA是免疫球蛋白。在组织处理上虽然有人提出用冷冻切片或福尔马林固定胰酶消化的方法，我们的体会用冷酒精直接固定法既简单又方便。 （3）SC和IgA除一部分在细胞内，也可以分布于间质和粘膜表面。为了提高特异性，除了染色前用琼脂扩散、对照试验、吸收试验和抑制试验等方法检验抗体的特异性和敏感性外，可采用伊文氏蓝作对比染色。伊文氏蓝肉眼下是蓝色，在荧光镜下是红色，混合染色后能衬托FITC的绿色荧光，同时抑制非特异性荧光，不影响抗原抗体结合。如果特异性染色后再加伊文氏蓝，比较费时间，效果不一定最佳。先用伊文氏蓝染组织切片，再进行特异性抗体染色能抑制抗原抗体结合，不宜使用。 2．染色步骤 （1）组织加工、固定及切片与抗体产生细胞研究（不需PBS浸洗）相同。先做HE染色，选纵向连续切片，脱蜡后在4℃PBS中浸洗3～5min，过一次蒸馏水后风干待染。 （2）用伊文氏蓝PBS稀释FITC标记的SC和IgA抗体，加在连续组织切片上，放入湿盒，37℃温箱放置45min。 （3）取出切片，用BPS浸洗3次，每次5～10min。 （4）过一次蒸馏水后风干，50%甘油封片，荧光显微镜观察。 3．结果判断和分析荧光镜下组织切片底色为红色荧光，SC和IgA呈绿色荧光。IgA和SC主要分布在分泌性腺体腔面、上皮细胞侧膜及基底部，IgA还分布在间质及固有层IgA产生细胞浆内。可根据荧光强度进行SC和IgA半定量分析，也可以用荧光光度计或数字减影技术进行准确定量。