三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合

一般用低分子量的双功能试剂把两者联结起来，常用的双功能试剂有间苯二甲基二异氰酸盐（简写XC）。甲苯2，4二异氰酸盐（简写TC）。邻茴香胺（简写BDD）；对，二氟一间，间，二硝基二苯矾（简写FNPS）和戊二醛。近年来，普遍认为戊二醛作为联结剂效果较好，对抗体活性影响小，标记抗体产量高。分为一步法和二步法，现简介如下： [b]1．一步法[/b] 以15mg 铁蛋白和3mg球蛋白溶于0.9ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中，pH7.0,加入0.1ml新鲜配制的戊二醛溶液，使其最终浓度为 0.005%～0.05%, 加入0.02%叠氮钠（NaN3）防腐，此混合液置37℃24h，无需搅拌，结合完毕后加0.01mol/L赖氨酸中止反应。 [b]2．二步法[/b] （1）在含50～80mg铁蛋白的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中，加入稀释的戊二醛，使其最终浓度为0.05%～0.15%，总体积为1ml。 （2）置37℃作用2h后，经葡聚糖G—25 滤柱，除去未结合的戊二醛。为避免不必要的稀释，只收集脱峰的中间部分。然后加入球蛋白（铁蛋白与球蛋白之比为5：1）即铁蛋白最终浓度为15mg/ml，球蛋白3mg/ml。 （3）混合液置37℃，作用12h（无需搅拌），加入0.01mol/L 的赖氨酸以中止进一步交联。两步反应都需在0.02% NaN2防腐条件下进行。