四、电镜标本的制备方法

[b]1．固定[/b] 　同常规电镜一样，应用醛类和四氧化锇双固定，以维持细胞和组织的超威结构。有文献报告以4%的甲醛溶液在pH7.2的磷酸缓冲内，在0℃进行固定，并用四氧化锇作后固定，不会影响抗原的反应能力。高锰酸钾能使大部分抗原失去活性，一般不宜采用。另外，铁蛋白标记抗体的特点之一是分子量大。因此，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液，否则需采取适当的措施，打破细胞膜，增强细胞对标记抗体的通透性，常采取以下方法： （1）冻融法：将小块组织或细胞经固定后，冻融一次，使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。 （2）冰冻切片法：固定后组织快速冷冻，切成10～15μm左右薄片，溶化的切片直接浸泡于铁蛋白标记抗体液中。 （3）有报道经戊干杯固定后，浸入4×10-3mol/L洋地黄皂甙液中1～2min，能有助于增强细胞膜的穿透性，使标记抗体液进入细胞内。 [b]2．免疫反应处理[/b] 　常用包埋前染色，分直接法和间接法两种。在染色前，将组织切成约10～20μm厚的薄片。 （1）直接法：将薄片直接浸泡于标记抗体液中，室温或37℃作用1～2h或更长；缓冲液（有人提倡用冷缓冲液）浸漂，除去未结合的标记抗体溶液，然后转入常规双固定和电镜包埋。 （2）间接法： ①将组织切片浸于第一抗体液中，室温30～60min。 ②以大量冷缓冲液充分搅拌洗涤，至少3次，每次30min。 ③浸入铁蛋白标记抗体液中，室温30min。 ④如②，用缓冲液充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片。 ⑤将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30min。 ⑥常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。