二、铁蛋白的提取和纯化

取健康的马脾（新鲜或冰冻均可），去除脾外的淋巴结和脂肪组织，按湿重1：1.5或1：2加入蒸馏水，用组织匀浆器将组织匀浆，置水浴中加热至75～85℃，使铁蛋白以外的蛋白质变性，冷却后用2～4层纱布过滤，滤液离心取上清液，每100ml上清液中加入35g硫酸铵，充分搅拌使铁蛋白沉淀析出，4℃过夜，3000～10000r/min离心20min，弃去上清液，刮取沉淀物置透析袋内，剩余沉淀物以蒸馏水洗后，一并加入透析袋内对水透析，除去硫酸铵。100ml中加入4～5g硫酸镉使炎结晶，在室温或4℃冰箱内使之出现铁蛋白结晶。此铁蛋白结晶以2%硫酸铵（pH5.58）溶解后，如上述再用硫酸镉使之结晶。反复溶解，结晶六次，达到纯化。纯化后铁蛋白在半饱和的硫酸溶液内可保存1～2年。用时以蒸馏水透析除盐后即可应用，应用前可以用负染色法在电镜下观察，了解铁蛋白的完整性和纯度。 商品制备的铁蛋白是用2%硫酸铵溶液稀释的1%～2%溶液（pH5.85）。为了在应用中得到满意的结果，应用前必须将商品制备的铁蛋白进一步纯化。纯化的方法是用0.1n NaOH或0.1n HCl调整pH值至5.85，然后加入20%硫酸镉溶液使其在铁蛋白液中最终浓度为5%硫酸镉，此溶液置于4℃冰箱内2h（或过夜）至结晶完成，离心1h（2000r/min）充上清液。铁蛋白结晶再溶解，离心除去不溶性颗粒，倾出上清液，加入5%硫酸镉再结晶，至在显微镜下呈棕红色铁蛋白结晶为止。将结晶溶于2%硫酸铵溶液中，用50%5硫酸铵溶液沉淀三次，第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸馏水中，先对自来水透析，再对0.05mol/L,pH7.5磷酸缓冲透析12～24h。纯化的铁蛋白溶液用100000r/min 超速离心2h ，除去3/4无色上清液，沉淀物（内含铁蛋白）在4℃过夜，待完全融解后，用微孔滤过器（Millipore filter, 孔径 0.25～0.45μm）过滤，保存1～2年内仍可使用。