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双特异抗体酶免疫染色法检测幽门螺杆菌抗体

自从1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌（Hp）后，已有越来越多的实验结果表明Hp与慢性胃和溃疡病有密切关系，可能是这些疾病的致病因素之一。目前诊断Hp的方法主要有组织培养法、尿素酶试验和各种染色法。鉴于这些方法繁琐、费时、须胃镜取材才能完成等，寻找一种敏感性高、特异性好、快速且简便的诊断Hp的方法，是目前急需研究和解决的问题。本文报道建立一种新的免疫酶技术—“双特异抗体”酶免疫染色法，现将结果报告如下。 [b]1　材料和方法[/b] 1.1　材料 ①试剂：辣根过氧化物酶（HRP），R2≈3.0，系中科院上海生化研究所产品。底物：3.3'二氨基联苯胺四盐酸（DAB－4HCI），瑞士产品。②“双特异抗体”的制备：人血清IgG的提纯按饱和硫酸铵四步盐析法进行。双抗原的制备按改良过碘酸盐法，用HRP标记纯化的人IgG，制成免疫用的双抗原。动物免疫。动物：体重分别为2.5kg和3.0kg的雄性家兔2只。免疫：初次免疫是将含HRP20mg，IgG5mg的双抗原加等体积的福氏不完全佐剂多点、多部位注射于每只家兔的四肢。间隔1月后用原剂量的双抗原加福氏不完全佐剂以同样方式进行第二次免疫。3周后用加倍的双抗原经耳静脉注射。7d后试血，当兔抗人IgG抗体和抗HRP抗体效价达1：32以上时颈动脉放血，分离血清－20℃保存。将双抗血清与人IgG和HRP同时做双扩散试验。琼脂免疫双扩散第1孔为双抗血清，第2孔为人IgG、第3孔为HRP，形成2条相互交叉的沉淀线。显示双抗血清与人IgG和HRP形成两条相互交叉的沉淀线。③Hp菌液的制备：将NCTC11638Hp标准菌株（由澳大利亚皇家佩思医院惠赠）和本院胃镜检查钳取患者胃粘膜分离培养获得的25株Hp菌株分别接种于心脑血平板培养基上，37℃微需氧环境培养3d～5d后进行生化学和形态学鉴定，传代培养后刮下菌苔制成菌液，以2‰甲醛固定，离心沉淀洗涤3次后测浓度。预实验使用标准菌液，正式实验采用混合菌液。④被检血清：随机抽取我院1988年胃镜检查患者的静脉血，分离血清低温保存。同时钳取胃粘膜做尿素酶试验（HpUT）、组织培养和病理查。 1.2　方法 将待测血清用生理盐水稀释成1：200滴于已固定Hp菌的玻片上，37℃温育30min，漂洗、风干。再加“双特异抗体”和HRP各一环，同上温育、洗涤后，加新配制的DAB一环，温育10min后漂洗、风干、油镜下观察结果。同时设阴性血清、PBS和正常兔血清对照。结果判断：根据菌体着色程度和是否膨大记以＋～+++。“＋”—菌体染色呈灰黄色，“++”—菌体呈黄色并膨大，“+++”—菌体膨大并呈黄褐色，“++++”菌体呈深褐色而膨大。当蓖体染色为“++”以上时为阳性。 [b]2　结果[/b] 2.1　双特异抗体酶免疫染色法（bispecificantibody　enzymatic immunostaining，BSABEIS）的建立 按方阵滴定法进行。将1.8×10[SB]9[/SB]/ml的Hp菌液一环固定玻片，再加1：2比稀释至1：128的阳性血清，温育洗涤后加1：2至1：64倍经稀释的“双特异抗体”和HRP（0.01mg/ml），同上温育洗涤后加底物液，10min后观察结果（表1）。表1所示，当阳性血清在1：64稀释的血清和1：16“双特异抗体”作为工作浓度。固定抗原（1.8×10[SB]9[/SB]/ml）和阳性血清（1：64）的浓度，将双抗按1：2至1：64倍比稀释，HRP从0.32mg/ml倍比稀释至0.005mg/ml，按以上步骤和条件进行染色，结果见表2。表2显示，HRP在0.005mg/ml，双抗在1：16以上时，均呈“+++”的阳性结果，为保证实验的准确性，正式实验选用0.01mg/mlHRP和1：16双抗作为工作浓度。 表1　阳性血清和双特异抗体最适浓度选择
双特异抗体不同浓度待测阳性血清染色镜检结果对照
1：21：41：81：161：321：641：128阴性血清PBS
1：2++++++++++++++++++++++－－
1：4++++++++++++++++++++++－－
1：8+++++++++++++++++++++－－
1：16+++++++++++++++++++++－－
1：32++++++++++++++++++++－－
1：64++++++++－＋±－－　
表2　双特异抗体和HRP最适浓度选择
双特异抗体不同浓度HRP（mg/ml）染色镜检结果对照
0.320.160.080.040.020.010.005阴性血清PBS
1：2++++++++++++++++++++++++++++－－
1：4++++++++++++++++++++++++++++－－
1：8+++++++++++++++++++++++++－－
1：16++++++++++++++++++++++++++－－
1：32++++++++++++＋＋－－
1：64±±±－－－－－－
特异性试验　分别用20亿/ml的Hp、霍乱弧菌、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、白色念珠菌、福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆菌、副伤寒杆菌甲、副伤寒杆菌乙、不凝集弧菌和空肠弯曲菌制成涂片标本，依次加Hp阳性血清、双抗体、HRP和底物染色后镜检、同时设阴性血清、PBS和正常兔血清对照。结果显示，除Hp呈+++的阳性染色外，其余细菌染色均呈阴性、对照组也均未着色。 敏感性试验　选择6份Hp阳性血清，按上述方法染色，同时与试管凝集试验和显微凝集试验进行对比。结果显示，本法测得抗体效价＞1280，显著高于试爱凝集（1：320）。 2.2　BSABEIS法的临床应用 用本法检测100例慢性胃炎和溃疡病患者血清，同时与培养法Hp和尿素酶试验HpUT进行对比（表3）。结果显示，本法阳性率（71％）高于HpC法（59％）和HpUT法（62％），但无显著性差异（P＞0.05）。三种检测方法检测结果符合率比较结果见表4～5。BSABEIS法与HpC法和HpUT法的总符合率分别是62％和61％。 表3　BSABEIS法与其它二种方法对比　　（n：100）
方法检测结果
阳性数阴性数阳性率（％）
BSABEIS100712971
HpC100594159
HpUT100623862
　　　　　　
表4　BSABEIS法与HpC法比较　　（n：100）
BSABEISHpC合计
＋－
＋462571
－131629
合计5941100
表5　BSABEIS 法与HpC法比较（n：100）
BSABEISHpUT合计
＋－
＋472471
－151429
合计6238100
[b]3　讨论[/b] 自NakaneAvrameas（1966）建立酶标抗体技术用于定位抗原以来，已发展了许多免疫酶技术，可归纳为二大类，即标记抗体和非标记抗体免疫技术，后者避免了标记过程中酶和抗体活性减弱及标记与未标记抗体间竞争干扰，从而提高敏感性和特异性。Steruberger等采用抗酶抗体法（PAP）检测钩端螺旋体，发现其录敏度较荧光抗体法比高100～1000倍。Petrali等也发现了PAP法比抗体搭桥法灵敏5～20倍。Moriaty等实验证实了PAP法优于放射免疫法。最近Milstein制备一种既抗抗原双抗酶的双抗体，提高了检测敏感性和特异性。本文建立的“双特异抗体”酶免疫染色法就基于以上原则而制成既抗人IgG又抗HRP的“双特异抗体”。经临床标床检测结果证实其所能测出的抗体滴度显著高于显微凝集法和试管凝集法（4～8倍），并与10种肠道菌均无交叉反应。检测Hp感染率高于培养法和尿素酶试验，总符合率分别是62％和61％，但BSABEIS法71例阳性中HpC法和25例示检出，HpUT法62例阳性中本法有15例未检出，可能病人尚处于感染初期，抗体水达到检出的水平。关于“双特异抗体”的本质有待进一步阐明。