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ELISA法检测幽门螺杆菌抗体

1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌（Hp）之后，Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极大的兴趣。人们推测其可能成为这类疾病的致病因素之一。许多研究者正进一步探索其致病机理，并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止，检测Hp的方法包括组织标本培养，切片染色，细菌直接涂片染色，快速尿素酶测定及[SB]13[/SB]C尿素呼吸试验和[SB]14[/SB]C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成，鉴于取材困难，进一步寻找检测Hp感染的免疫学方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测临床病人血清中有Hp抗体报道，国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一种检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果，研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应，现将结果报告如下。 [b]1　材料和方法[/b] 1.1　材料 ①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三厂产品。②酶联板离心篮：根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。③DG—Ⅰ型酶联免疫检测仪：南京华东电子管厂产品。④试剂：过氧化物酶（HRP），R[SB]2[/SB]＝3.2，美国Sigma公司产品。邻苯二胺（OPD）：上海白鹤化工厂产品，按文献配制。包被液：取碳酸钠1.59g加碳酸氢钠2.93g，蒸馏水1000ml配成。洗涤液：以上未加吐温—20的洗涤液100ml＋2％小牛血清＋4％聚乙二醇（PEG）。封板液：5％小牛血清。戊二醛固定液：25％戊二醛液，100ml装，Kochligh进口分装，用时稀释成0.25％戊二醛固定液。终止液：2NH[XB]2[/XB]SO[XB]4[/XB]。⑤抗原的制备：将澳大利亚皇家佩思医院的Hp标准菌株（NCTC11638）及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板，37℃培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定（自制兔抗Hp抗体），然后取单个菌落移种于另一血平板，继续培养3d，经鉴定后将其大量增殖培养，3d后将菌苔刮下，置生理盐水中制成菌液，加福尔马林固定（0.1％～0.3％），4℃过夜，3000r/nin离心30min，沉淀3次，将最后1次沉淀悬于少量PBS液内，用比浊管没出细菌浓度，制成含菌3×10[SB]9[/SB]ml，置冰箱冰冻，反复冻融3次，经显微镜检查无菌体存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，－20℃保存备用。⑥临床血清标本：采自胃镜检查患者，随机采取1988年8～10月胃镜检查病人共38人，抽静脉血2ml，分离血清贮存－20℃备用。⑦阴性对照血清，进行ELISA测定，取其平均OD值作对照。⑧酶标羊抗人IgG结合物（SAHIgG—HRP）的制备：按过碘酸盐改良法，略加改进标记制成酶标抗体。即HRP8.0ml，22℃较搅20min。加乙二醇6滴，继续搅拌5min，对pH4.2，0.001mol/L醋酸盐缓冲液（用2molHC1调pH）透析过夜，中间换水4次，加羊抗人IgG（上海生物制品研究所产品）14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸盐缓冲液，使pH升到9.0～9.5，室温较搅2h，加硼氢化钠（4mg/ml）0.2ml，置4℃2h，对pH7.2，0.01molPB－0.4molNaCl缓冲液在4℃透析平衡。换水4次，收取透析袋内结合物，以50％饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后，测定精制结合物，E/P克分子比值合格后，将结合物小瓶分装置－20℃保存，备用。⑨尿素酶测定法和Hp的分离培养法参考文献进行。 1.2　方法 并稍加改进，即：抗原包被微量滴定板：用包被液将抗原按2×10[SB]8[/SB]亿/ml（含蛋白8.6μg）稀释后，每孔加100μ，离心篮离心20min2000r/min后，倒去孔内液体，然后加入0.25％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗涤液洗3次（每次3min），加5％小牛血清液，200ml/孔，经37℃30min封板后倒去孔内液体。每孔加待检血清(1：100稀释)100ml，37℃保温1h后，如上洗涤3次，同时做阴性对照孔和空白孔。之后于各孔内加和新鲜稀释的酶标羊抗人IgG结合物100ml，37℃保温半小时，于各孔中加入2NH[XB]2[/XB]SO[XB]4[/XB]50μl终止反应后，于酶联测定仪以波长490nm测定OD值，将测得标本OD值（P）与阴性对照OD值（N）比（P/N），若P/N比大于或等于2.0为阳性。 [b]2　结果[/b] 2.1　ELISA的建立 为了知道所制备的SAHIgG－HRP在是接ELISA中的活性（结合第一抗体，效价），将此酶标抗体稀释成1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000，1：512000六种浓度，将作第一抗体的已知病人Hp感染阳性血清稀释成1：100包被微板的Hp抗原浓度为2×108mg/ml，按上述步骤和主法进行ELISA试验。结果表明，所标记的羊抗人IgG酶标抗体当稀释度为1：32000～1：512000时，它们的P/N值均为≥2.0，因此，了保证实验结果稳定采用个单位效价，即用1：256,000稀释度作正式实验（注1：512000为一个效价单位）。 为了解Hp抗原在包被微量滴定板中最适浓度，将Hp抗原用抗原包被液分别按蛋白浓度稀释成0.27，0.54，1.08，2.15，4.3，8.6，17.2及34.4μg/ml8种浓度，然后分别进行包被，与第一抗体阳性血清(1：100)和SAHIgG—HRP(1：256000)按上述步骤和方法进行ELISA试验。结果，当Hp抗原浓度为8.6～17.2％μg/ml时OD值最高，Hp抗原在34.4μg/ml时，OD值下降，因此Hp抗原包被量最适浓度为.8.6～17.2μg/ml。以后实验用此抗原浓度包板。 为了确定用ELISA测定病人抗Hp抗体的阳性血清浓度，用Hp抗原8.6μg包板，SAHIgG—HRP仍用二个单位（1：256000），将二份阳性血清混后后稀释成1：50，1：100，1：200，1：400和1：800五种浓度进行ELISA试验，测定OD值的结果。结果显示阳性血清稀释度与OD值呈较好的线性关系，当血清稀释度为1：50时OD值为1.521，1：100时OD值是1.172，P/N比值均大于2.0，故以后实验中第一抗体的血清浓度均用1：100的稀释度。 为了验证ELISA间接法用于检测Hp抗体的特异性，进行特异性吸收试验。选用8份Hp感染性血清以1：50稀释，加等量Hp菌悬液，混匀置37℃半小时，再置4℃过夜吸收后离心取上清液按上述实验条件和方法进行ELISA测定，结果见表1。 表1　特异吸收抑制试验结果
吸收处理8份阳性血清的OD值
12345678　
未吸收1.5881.2301.2201.5551.4201.3841.3541.266
吸收后1.3660.9800.9171.0481.0391.0390.9990.677
抑制结果＋＋＋＋＋＋＋＋
从表1结果可知，阳生血清经吸收1次后，OD值均较吸收前下降，特别8号血清前后相比下降了50％，由此均显示特异吸收抑制试验阳性，证明该8份阳性血清的抗Hp抗体是特异的。为了探索所建立的ELISA间接法检测抗Hp抗体的敏感度，选择6份抗p阳性血清按上述实验条及方法进行ELISA检测，同时与试管凝集试验和显微凝集试验进行比较，结果见表2。 表2　ELISA测定Hp抗体敏感比较结果
吸收处理6份抗Hp阳性血清测出的最终抗体滴度
1234567　
ELISA＞800＞800＞800＞800＞800＞800＞800
试管凝集160320320640320320320
显微凝集320320320320320320320
数字为稀释倍数的倒数 从表2结果表明，6份抗Hp抗体阳性血清用所建立的ELISA间接法测出的抗体效价均＞1：800，试管凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1：160～1：640，显微凝集试验测出的抗Hp抗体效价为1：160～1：320，显然ELISA法比后两者方法敏感的多。 批内误差　将4份阳性血清标本在同一块板上按上述方法重复进行9次ELISA试验，计算各份标本检测OD值结果的变异系数（表3）。 表3　4份阳性血清重复9次ELISA检测(x)
阳性血清号　
　1234
x0.5100.3940.4160.207
SD0.0280.0320.0300.014
SV（％）5.68.17.196.57
从表3得知，批内误差范围是5.5％～8.1％，平均6.87％，显示按上述实验条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA的稳定性好，重复性佳。 批间误差　将5份阳生血清，按上述方法及实条件在1W内反复进行3次ELISA，计算各份标本检测OD值结果的变异系数（表4）。结果指出三批阳性标本的变异系数在0.74％～8.12％之间，平均4.67％，由此亦显示按上述实条件建立的检测Hp抗体的间接法ELISA重复性和稳定性均良好。 2.2　临床标本检测结果 将胃镜检查患者的血清以1：100稀释，用上述实验条件建立的ELISA间接法进行，Hp抗体（ELISA－HpAb）检测，同时将同一患者胃粘膜进行Hp分离培养（HpC）和Hp尿素酶测定（HpUT），以资比较（表5）。 表4　5份阳性血清标本进行ELISA的批间误差试验结果
标本号分批检测阳性血清的OD值XSDSV（％）
123　
11.2661.1211.2071.1980.0736.09
21.1081.0211.1011.1120.0494.36
31.2091.0281.1251.1210.0918.12
41.0601.1421.1351.1120.0454.04
51.1121.0961.1071.1050.0080.74
表5　ELISA法培养法和尿素酶法对比
方法n检测结果
阳性数阴性数阳性率（％）　
ELISA－HpAb3834489.4
Hp培养法38231560.5
HpUT法38221657.9
表5结果指出，ELISA－HpAb法的阳性数为34/38（89.4％），Hp培养法的阳性数23/38（60.5％），HpUT法的阳性数为22/38（57.9％），表明ELISA－HpAb法敏感性较另二法都高（ELISA与CP培养法比较X[SB]2[/SB]＝8.94，P＜0.01。ELISA－HpAb与HpUT比较X[SB]2[/SB]＝9.77，P＜0.01。）38例患者用ELISA－HpAb法与培养法（HpC）和HpUT法结果符合率比较，结果见表6及表7。 表6　ELISA－HpAb法与HpC法符合率比较
ELISA－HpAbHp培养法合计
＋－　
＋221234
－134
合计231538
表7　ELISA－HpAb法与HpUT法符合率比较
ELISA－HpAbHpUT合计
＋－　
＋221234
－044
合计221638
表6及表7比较结果表明，ELISA－HpAb与HpC法的总符合率为65.80，与HCPUT法总符合率为68.4％。在ELISA－HpAb法的34例阳性中HpC法和HpUT法的23例及22例阳性中，ELISA－HpAb法只有一例未检出，由此均表明，ELISA－HpAb法比HpUT法敏感。 [b]3　讨论[/b] 关于诊断Hp病的血清学方法，至目前为止主要有补体结合试验，被动血凝集试验，细菌凝集试验等法。但由于这些方法操作繁锁，或敏感性低，或可靠性欠佳，故现已较少采用。自ELISA法建立以来，证明具有敏感性高，稳定性强等优点，国外报道已有人用此法来检测人血清中抗Hp抗体，也证实特异、敏感。但国内尚未有报道证实此法能否用于Hp抗体的检测和诊断Hp感染。本文报道所建立的检测Hp抗体的间接ELISA法实验和初步用于临床标本检测结果证实具有较好的特异性，敏感性（比试管凝集和显微凝集试验敏感＜2～3倍）和重复性。为快速诊断Hp提供较好的方法（表1～7）。然而其中操作步骤除按文献报道的一般流程（Hp抗原包被微板→甲醛固定→封闭（牛血清白蛋白）→人Hp抗体温育→羊抗人IgG酶标抗体温育→底物显色→酶联测定仪测定）外，作了若干改进：①Hp抗原的制备：根据文献报告，抗原的制备有超声粉碎，福尔马林固定处理等方法。但Goodwin等认为经过盐酸—甘氨酸制成的可溶性抗原应用于ELISA更加可靠。本文采用抗原是经过福尔马林杀死和固定，用PBS洗三次，置冰箱反复冻融3次后制成的Hp抗原，用蛋白浓度为8.6μg/ml包被微板亦可获得满意结果。②通过2000r/min，20min离心沉淀，戊二醛合固定30min的抗原代替过夜包被同样得到满意结果。③检测血清标本阳性的稀释度（阳性滴度或阳性单位）：Goodwin等的报告，用ELISA检测病人血清抗Hp抗体的滴度认为在＞1：300（或＞300EU）与Hp的胃疾患非常接近。本文通过选择10岁以下儿童血清作正常对照和已知Hp阳性血清进行ELISA试验，根据P/N≥2的判定阳性标准原则结果表明以1：100以上（或＞100EU）作为阳性血清标本6份滴度较高的与试管凝集和显微凝集试验对比测定，结果表明，在后二者方法中，均有1：320的抗Hp抗体（表2）。由此也证明用儿童血清作正常对照用用此判断阳性标准是可靠的；同时证实这些病人血清中确实有较高抗Hp抗体。但是，此等判定阳性标准是否非常合适还待进一步实践证实。 ELISA－HpAb法与HpC法和HpUT法的结果比较，前者比后二者的阳性数高（89.4％），符合率分别是65.8％和68.4％（表5）。但常规培养法需时3d～7d，HpUT法较快速，但受活检粘膜内菌量多少及取材部位影响较大，短暂停留在胃内的肠道菌易造成假阳性结果。因此特异性不如ELISA－HpAb法。但是，ELISA－HpAb法与HpC和HpUT法检出的阳性病例数与胃镜检查的诊断和病理诊断是否完全相符，有待进一步的研究和分析。