三、ApoB基因多态性检测方法举例

以ApoB基因第26个外显子MspⅠ RFLP为例，具体介绍检测的方法和步骤，笔者对湖北地区健康成人（120例）进行了检测。 [b]（一）材料[/b] 引物（如前所述），TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶MspⅠ、高速离心机、基因扩增仪、恒温水浴箱、电泳系统、紫外监测仪。 [b]（二）方法[/b] 1.模板DNA的提取 可采用改良的TritonX-100法提取人白细胞DNA，此法结果稳定，但操作较繁琐，在此采用改进的Na裂解法提取人白细胞DNA，简便、快速、灵敏、经济，步骤如下： 取EDTAN[XB]a2[/XB]抗凝血100μl，15000r/min离心5min，弃上层血浆，加无菌双蒸水200μl，摇匀20s，加6mNaI200μl，摇匀20s，再加入氯仿/异戊醇（24/1）400μl，摇匀后15000r/min离心12min，小心吸取上层水相，移入另一离心管，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃放置15min，15000r/min离心12min，弃异丙醇，加入70%乙醇洗涤2～3次，室温干燥，加入5μlTE缓冲液（pH=8.0）溶解DNA12～24h，4℃备用。 2．模板DNA的扩增 采用聚合酶链反应（PCR）。反应总体积50μl，MgCl[XB]2[/XB]终浓度为1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l，引物各20pmol,模板DNA约1.0μg，混匀，短暂离心，95℃预变性10min，加入Taq酶1.5U，液体石蜡50μl，短暂离心，按94℃ 45sec，60℃ 45sec,72℃1mim 15s循环30次，72℃延伸5min，置4℃贮存。 3．扩增产物的提纯及酶切 取扩增产物20μl，加入醋酸铵至2.5mol/L,与无水乙醇混匀，4℃沉淀15min，12000r/min离心10min，弃上清，70%乙醇漂洗两次，室温干燥后加入含Mspi 10U的缓冲液37℃保温2h，加入EDTA至10mmol/L终止反应。 4．扩增及酶切产物的检测 （1）琼脂糖电泳：制备2%琼脂糖（含0.5μg/ml EB），将扩增产物与标准DNA（PGEM3zf（+）/HaeⅢ）点样，电压4v/cm，电泳，紫外灯下观察。 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将扩增及酶切产物加样于8%聚丙烯酰胺凝胶上，电压6V/cm，电泳4h，EB染色，紫外灯下观察。 （3）结果：扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外灯下呈一条强荧光带，与已知DNa Marker相比较，约位于480bp的位置，与设计相符。 扩增产物经MspⅠ酶切后，在8%PAGE上，可见到三种类型：①原始带消失，出现两条新带，长度为395bp和85bp，为含酶切位点的M[SB]+[/SB]M[SB]+[/SB]纯合子；②酶切后除与扩增产物相同位置的原始带外，还有两条长度为395bp和85bp的带，共三条带，为M[SB]+[/SB]M[SB]-[/SB]杂合子；③酶切后仅有一条带，与扩增产物位置相同，为无酶切位点的M[SB]-[/SB]M[SB]-[/SB]纯合子。 以上三种基因型，以含酶切位点的纯合型（M[SB]+[/SB]M[SB]+[/SB]）最多见，120例中有114例，不含酶切位点的M[SB]-[/SB]M[SB]-[/SB]型最少见，仅有1例，杂合型（M[SB]+[/SB]M[SB]-[/SB]）有5例，根据基因频率计算方法，等位基因M[SB]+[/SB]频率为0.97，少见等位基因M[SB]-[/SB]频率为0.03。 若对冠心病患者同时进行检测，计算基因频率，可见到：少见等位基因M[SB]-[/SB]在冠心病组比健康对照组高，有显著性差异，但无论在冠心病组还是健康对照组，各基因型个体间的血脂、脂蛋白、载脂蛋白水平均无显著性差异，这说明Apob MspⅠ多态性与冠心病有关，但与血中脂类水平的关系不明显，这可能是由于环境因素，激素及其他遗传因素对脂质水平的影响较明显，掩盖了Apob MspⅠRFLP对脂质的影响，也可能是这种多态性与ApoB基因上其他位点的多态性有连锁关系。另外，由于少见等位基因M[SB]-[/SB]的频率很低，有必要加大样本例数，进行进一步的研究。