二、ApoB基因多态性的检测

ApoB基因多态性研究较多的有RFLP、VNTR、SP多态性，分别叙述如下： 1．RFLP的检测 ApoB有10种RFLP，一般采用PCR-RPLPs方法进行分析，研究较多的有第26外显子XbaⅠ、MspⅠ位点，第29外显子EcoRⅠ位点，在Apob DNA上的位置如图19-6，图19-7所示： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua155.jpg[alt]ApoB基因部分RFLPS示意图[/alt][/img] 图19-6 ApoB基因部分RFLP[XB]S[/XB]示意图 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua156.jpg[alt]ApoB基因多态性位置示意图[/alt][/img] 图19-6 ApoB基因多态性位置示意图 用于PCR的引物如下： XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT EcoRⅠ-5’CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT XbaⅠ酶切位点的RFLP是由于2488位密码子第三个碱基突变（ACC→ACT），产生一个XbaⅠ酶切位点，但并未改变所编码的氨基酸序列，存在XbaⅠ酶切位点（X[SB]+[/SB]）的等位基因，其PCR产物酶切后出现433bp和277bp两个片段，不存在XbaⅠ酶切位点（X[SB]-[/SB]）的等位基因，PCR产物经酶切后仍为其产物710bp片段。 RFLP是由于4154位密码子改变（GAA→AAA），使原有的EcoRⅠ酶切位点消失，氨基酸序列中赖氨酸取代谷氨酸，存在EcoRⅠ酶切位点（R[SB]+[/SB]）的等位基因，其PCR产物经EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp两个片段，不存在EcoRⅠ酶切位点（R[SB]-[/SB]）的等位基因，其PCR产物酶切后仍为480bp的片段。 MspⅠ酶切位点的RFLP，是由于3611位密码子改变（CGG→CAG），谷氨酰胺取代了精氨酸，含MspⅠ酶切位点（M[SB]+[/SB]）的等位基因，PCR产物经MspⅠ酶切后可见到395bp和85bp的片段，不含MspⅠ酶切位点（M[SB]-[/SB]）的等位基因，PCR产物酶切后仍为480bp。 众多学者对ApoB基因RFLP[XB]s[/XB]与动脉粥样硬化之间的关系进行了研究。多数学者认为ApoE有XbaⅠ酶切位点（X[SB]+[/SB]），无EcoRⅠ酶切位点（E[SB]-[/SB]），无MspⅠ酶切位点（M[SB]-[/SB]）的基因频率，在动脉粥样硬化性疾病的患者中比正常对照组高，但也有学者持不同甚至相反意见，究其原因，可能有以下几点：①研究样品例数不够，有的少于100个甚至少于50个，可能使一些有意义的联系被忽略；②对照组的选择没有统一的、严格的、明确的标准，有时与病员组缺乏可比性；③存在种族差异，例如XbaⅠRFLP基因频率，X[SB]+[/SB]等位基因在高加索人为0.4～0.5,日本人和中国人则仅为0.04、0.01；④某些遗传标记之间可能存在连锁关系，可导致结论互不相同。 2．VNTR的检测 VNTR（数目可变的串联重复顺序）是继RFLP[XB]s[/XB]之后的又一类具有高度多态性的遗传标记，广泛分布于人类基因组中。ApoB基因3’端高变区（HVR）包含VNTR，由富含AT的DNA序列组成，其多态性特点是由10～15bp的核苷酸序列构成不同的等位基因，产生不同的重复序列拷贝数。以VNTR两侧特异性序列为引物，经PCR扩增后直接电泳分析产物，片段之间的差异在于AT重复次数不同，重复37次称为3β'37。依此类推，PCR引物可用以下序列： VNTR-5’ATGGAAACGGAGAAATTATG VNTR-3’CCTTCTCACTTGGCAAATAC Boerwinkle等首先检测出12种等位基因片段，现有学者已检出22种不同等位基因。Frield等的研究发现，产生38、44、46或48个15bp长度重复序列的等位基因与冠心病、血浆胆固醇水平升高有关，且与EcoRi RFLP呈连锁不平衡，与MspⅠRFLP呈连锁平衡，Robinson等的研究则没有发现ApoB的VNTR多态性与血浆胆固醇、甘油三酯、ApoB等水平有关。 3．信号肽（SP）多态性的检测 ApoB基因5’信号肽（SP）由27个（插入型Ins）或24个（缺失型Del）氨基酸组成，可经PCR扩增后直接分析，用于PCR的引物序列为： IN/DE-5’CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA IN/DE-3’ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA Wu等报告del/del基因型在高胆固醇血症患者中比对照组中多见。Renges等对伦敦地区亚洲后裔的研究也发现带del基因型者血浆总胆固醇升高，但与冠心病无明显关系。Peacock等提出Ins/del多态性与冠心病的发展，即其严重程度有关，也有报道Ins/del多态性在冠心病与对照组中无明显差别。