（四）外周血培养及染色体制片技术

1．国内应用的外周血培养染色体技术 （1）原理：外周血染色体制备是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术，亦是基本的实验技术，由于取材容易，培养过程比较简单，短期内可以得到结果，所以其实用价值很高。 血液中含有红、白两类细胞，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核，无分裂能力；白细胞类虽有细胞核存在，但是外周血中处于休止期。植物血球凝集素（简称PHA）能促使淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞。染色体只有在细胞分裂中期时最典型。秋水仙素类药的药物能抑制纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，低渗处理使细胞膨胀，细胞膜破裂，染色体分散，这样就可便于分析。 简意流程图： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan109.jpg[alt] 外周血培养染色体技术[/alt][/img] （2）操作过程 ①采血：无菌干针筒从静脉取血1～2ml，用肝素抗凝（约每毫升全血内含肝素100单位）。 ②培养液配制：RPMI 1640 4ml 小牛血清　1ml 1%PHA（自制）0.2ml 调节　pH为7.4后置于-20℃冰箱 ③标本接种：每5ml培养液加入抗凝全血0.5ml。 ④培养细胞：将接种好的培养瓶置于37℃恒温箱中培养72h。 ⑤阻止分裂：培养至68h，加秋水仙素，最终浓度0.02μl/ml，摇匀后置于37℃恒温箱中继续培养4h。 ⑥收获：培养物混合后，置于10ml离心管内，离心10min（1000转/min），去上清液。留下培养物。 ⑦低渗处理：低渗液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl）5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保温20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸）1ml用吸管打匀，预固定1～2min。 ⑧离心：1000转/min离心10min。 ⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管将沉淀物打散，固定30min后离心，1000转/min离心10min，取出吸去上清液留下沉淀。 ⑩重复上述固定离心1次。 ⑾标本制作：最后1次固定、离心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鲜固定液约0.3ml打散细胞悬浮液即可进行制片。制片之前先将载玻片经清洁液洗净处理后，置于冰箱内制成冰片。取冰片1张滴上2～3滴细胞悬液。利用冰片的表面张力关系使液体迅速向玻片四周散开，与此同时用嘴轻轻吹向滴片处，以助其更快散开，然后在酒精灯火上通过7～8次后，自然干燥或烤干均可。 ⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸缓冲液9份，混合后，染色20min，蒸馏水洗去余下染液，晾干，镜检观察。 （3）注意事项 ①无菌操作是关键。培养液不得污染。 ②所用药品不得失效，特别是PHA，既要使淋巴细胞转化，又不能过量。 ③小牛血清优质、无菌。 ④秋水仙清素低浓度4～6h效果最佳，过量则染色体易收缩。 ⑤固定液和Giemsa染液要求新鲜配用。 ⑥培养时间72h较好。 （4）各种物品清洗与消毒 ①玻璃器皿用后，立即用自来水冲洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗。待干，泡入清洁液24～48h，取出，自来水冲洗，再用双蒸水冲洗，干后备用。 ②接触洗液时，带上橡皮手套，围裙等防护品。 常用清洁液配制： 重铬酸钾25g 水200ml 浓硫酸1000ml ③先将重铬酸钾在水中溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，防止过度发热。使用3～6月后检查，若变绿表示失效。 ④G[XB]5[/XB]、G[XB]6[/XB]漏斗的处理：水洗净、晾干，于浓硫酸泡（或洗液中泡）24h，再用蒸馏水冲洗至加入1%BaCl[XB]2[/XB]滴无白色沉淀为止。包装消毒，15磅20min。 （5）橡皮塞的处理 新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水冲洗10min，用双蒸水泡24h，双蒸水冲洗，晾干，15磅20min高压灭菌。 （6）金属器械清洗 先用纱布或纸擦去防锈油，然后用洗涤液清洗，再用清水或蒸馏水洗净，擦干或烘干备用。 2．外周血细胞培养法（Bhatt B and McGee JOD,1990） （1）收集静脉血（无菌），加肝素抗凝（20单位/ml）； （2）加0.8ml全血入每个培养瓶（含10ml培养液），37℃培养72h； 培养液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M) 小牛血清　20ml PHA　 2.0ml （3）加100μl Brdu于培养瓶中，37℃再孵育16～17h； （4）离心（1200rpm）8min，弃去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培养液，混匀； （5）重复步骤（4）； （6）沉淀中加入10ml新配制的完全培养液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶），重新置于37℃孵育6～7h； （7）在收获培养细胞前15～30min，可加Colcemid,但当同时应用BrdU时这就并非十分必要。因为BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，能使染色体在富含异染色质处断裂分解，从而使显带明显； （8）1200rpm离心培养细胞，弃去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先预热至37℃），继续加入0.56%KCl使总容量达到10ml，在37℃孵育10min； （9）如上述离心，弃去上清液，在沉淀的细胞内加入新鲜的冷固定剂，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鲜配制，保存在冰上），置冰上至少20min； （10）重复步骤（9）3～4次，直至细胞悬液清洁无色； （11）可较长期保存在冰的固定剂内（-20℃）或再离心后加入0.5～1.0ml新鲜固定剂，置于冰上； （12）玻璃载片放在Decon（清洁液）或其它的清洁液内过夜，次日用自来水冲洗，继之蒸馏水漂洗，在60～75℃干燥，然后把载片孵育在2%丙酮液内，室温，60min。自来水冲洗，再在60～75℃干燥； （13）每张载片上加10μl的细胞混悬液，空气干燥，在24h后可应用于杂交实验，也可保存在-4℃达8周之久（试剂配制法见附录四）。