（三）高分辨染色体G带技术

1．原理常规的G带显带技术，在人类染色体中仅观察到320～450条带纹，对于一些染色体细微结构异常的识别是不够的。 氨甲碟呤抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸转变为四氢叶酸，从而干扰了脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成，阻止了DNA的复制，使细胞被阻止在S期内。胸腺嘧啶核苷解除氨甲喋呤的作用，让被阻滞的细胞同时开始进行DNA复制，进而同步分裂；放线菌素D可增加染色体的长度，能显示更多的亚带。放线菌素D与核酸相互作用：①插入脱氧鸟嘌呤核苷酸和脱氧胞啶核苷酸之间，使DNA变长；②能与染色体缩短有关的特殊蛋白和DNA结合，因此，抑制了染色体正常的收缩过程。秋水仙胺抑制纺垂丝的形成，可以得到较多的晚前期、前中期、早中期的分裂相。这样染色体带纹可增加到500和850条，甚至可达1200～2000条之多。这一步对于研究较细小的染色体缺陷的基因定位，具有很大的意义。 2．材料和方法 （1）4ml培养液（为从日本进口的RPMi 1640或从美国进口的F10液）虽自制的小牛血清1ml。每ml加青、链霉素各100单位，pH=7.2。 （2）每瓶培养液内，另加自制的PHA或重庆产的PHA2.5mg。 （3）取外周血2ml，分别装入含培养液的4个培养瓶内。 （4）37℃孵育箱内培养72h。 （5）加入氨甲喋呤，最终浓度10[SB]-7[/SB]mol/L，继续培养17h。 （6）用不含血清的培养液冲洗两次后，将上清液吸出，再加入含胸腺嘧啶核苷（最终浓度为10[SB]-5[/SB]mol/L）的培养液，继续培养3h。 （7）再加入放线菌素D，最终浓度为3μg/ml，培养2h。 （8）加秋水仙胺，最终浓度为0.03μg/ml，培养2h。 （9）按常规染色体技术制片。 （10）按一般常用的G带显带技术，显示带纹。 3．注意事项 （1）高分辨染色体，重叠多，应增加固定次数和固定时间，可置于4℃冰箱存放24h后制片，用高距离滴片，以使染色体分散开。 （2）细胞培养液同步化后，如果用5-溴-2脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU），则需加黑物包装进行暗培养。