七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin）标记核酸探针

1988年德国Boehringer Manheims公司推出了一种地高辛标记DNA检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至dUTP上，用随机引物法标记DNA制成探针。平均每20～25个核苷酸中标记一个地高辛甙元，然后用抗地高辛抗体的Fab片段与碱性磷酸酶的复合物和NBt – BCIP底物显色检测，灵敏度达0.1pg DNA，因此可做1μg哺乳动物DNA中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性，安全稳定，操作简便，可避免内源性干扰，是一种很有推广价值的非放射性标记探针。 标记方法步骤：（1）取一小离心管（0.5ml）插入冰浴中，加入待标记DNa 1μg/5μl，95℃变性10min，迅速移入盐冰中3min。加入六核苷酸引物2μl，Dig-dNTP标记物2μl和消毒双蒸水10μl、大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(单位)。（2）短时离心，37℃孵育至少60min（20h以内）。（3）加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反应。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl预冷的乙醇（-20℃），放入-70[SB]℃[/SB]至少30min或-20[SB]℃[/SB]过夜。（4）离心（12000g）10min，弃上清，再加入70%乙醇（冷）40μl洗一次，离心，抽干，再溶于50μl TE溶液（pH8.0）中，分装，-20℃存放备用。