六、生物素随机引物标记探针方法

以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Pharmacia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl[XB]2[/XB],10mmol/L β巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水补足体积至48μl，加DNA聚合酶（SABC）8u，混匀，37[SB]℃[/SB]，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，终止反应。 在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%）比值为35%时，其标记率最高，显色灵敏度达0.2pg，杂交灵敏度为1～2pg。二步法缺口平移标记HBv DNA探针，其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg等（Focus,1992；14：21）证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的dTTP，能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。