二、光敏生物素标记核酸探针

光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等；只需光照，探针稳定，-20℃可保存12个月以上。适用于DNA和RNA，抗体和酶等的标记。在原位分子杂交，斑点杂交和Southern印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有试剂盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。 方法步骤：在一灭菌Eppendorf管中加待标记DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下10cm处照射20min。加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA10μl混匀。再加入等体积仲丁醇，混匀。离心1min（10000r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。再加入仲丁醇25μl，重复提取游离的光敏生物素。吸去上层无色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精100μl充分混匀，沉淀标记DNA，置-20℃过夜（或-70℃15min）15000r/min离心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，离心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，测定探针浓度，分装，保存于-20℃。