一、生物素标记核酸探针方法

生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种,如生物素-11-dUTP,可用缺口平移或末端加尾标记法。实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上,合成TTP或UTP的类似物。在离体条件下,这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I(DNA酶I)的底物掺入带有缺口的DNA或RNA,得到生物素标记的核酸探针。这种标记方法称为缺口平移法。用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记物进行检测。 缺口平移法标记生物素DNA探针:在硅化Eppendorf管(放入冰浴中)加下列反应液: 待标记DNA 0.1μg/μl 5μl 10×NTB 1μl DNase I2pg/μl 1μl 消毒三蒸水  3μl 总体积达10μl 混匀,37℃,15min。离心10000r/min 1min后,放入冰浴中,继续加入下列反应液: dNTP(ACG)0.5μg/ml2μl Bio –11–dUTP 0.5μg/ml2μl 10×NTb 4μl 消毒三蒸水 31μl 混匀,短暂离心后,加入 DNA聚合酶I(5u/μl)1μl总体积50μl 混匀,14℃过夜(10h以上),加入 终止液 2μl 经Sephadex –G –50柱分离,回收生物素标记DNA。 10×NTB配法:500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5;100mol/L MgCl[XB]2[/XB];80mmol/L β-巯基乙醇,500μg/ml BSA。 终止液:0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。 缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好,即每次标记DNA不超过1μ.Bio –11-dUTP要浓贮,分装,-20[SB]。[/SB]C保存,反复冻融常会降解失活。Bio –11- dUTP贮存液:10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀释液,分装成3μl/支,-20℃保存。 地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。 乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便,即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇,混匀,-20℃放置30min,12000r/min离心5min,去上清,用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物,倒置离心管,晾干,用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物(0.1μg/μl)-20[SB]。[/SB]C保存。用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸,因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。