(三）非放射性探针的显示体系

1．AP显色体系 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan095.jpg[alt] AP显色体系[/alt][/img] BCI –OH+NBT→紫色↓ ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。 2．HRP显色体系 HRP + H2O2[HRP·H2O2] ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]枣→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O ODA：邻-联茴香胺。 3．ABC显色体系 DNA –B+ SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP 经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。这里SA为Streptavidin（链酶亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（biotin），ABC为Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。 以上反应AP亦可用HRP代替。 表18-3曱核酸探针的标记分子

标记物性质	标记分子	标记方法	杂交体的检测法
放射性分子	[α-32P]dNTP	NT、PCR、RPI	放射自显影或计数
	[γ-32P]dNTP	TL	放射自显影或计数
	125I	碘化	放射自显影或计数
	35S	NT	放射自显影或计数
	3H	NT	放射自显影或计数
非放射性分子
生物素	Bio-11-dUTP	NT、TL、PCR	酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
	光敏生物素	600W 可见光照	同上
	生物素化补骨脂素	365nm紫外线照	同上
	生物素酰-e-氨基乙酸	化学合成法	同上
	N-羟基丁二酰亚胺脂		酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
	生物素肼	化学合成法	酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
酶	微过氧化物酶	直接法或合成法	直接底物显色或用酶标抗体+ 底物显色
	碱性磷酸酯酶	直接法或合成法	同上
荧光素	罗丹明和FITC	合成法	直接荧光显微镜观察或酶标抗体+ 底物显色
化学发光标记物			化学发光测量或自显影
抗双链单抗	酶标或荧光标记单抗	化学法	直接底物显色
稀有金属	Eu3－	化学法	时间分辨荧光
重金属	Ag	化学法
	Hg	化学法
半抗原	磺酸胞嘧啶	化学法	酶标单抗 + 底物显色
	地高辛	RPL	酶标抗体 + 底物显色

* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记 4．非放射发光自显影若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光子的化合物，可用自显影技术暴光X线片显示。 （1）HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2的作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光（波长428nm）。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图： （2）AP的发光自显影：AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。 其发光反应的原理如下： HRP的发光原理： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan096.jpg[alt]HRP的发光原理： [/alt][/img] AP的发光原理： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan097.jpg[alt]AP的发光原理： [/alt][/img]