（二）核酸探针的非放射性标记技术

1．光敏生物素标记核酸　目前使用的光标生物素试剂有两种：光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照（320～400μm）下，可与单链或双链核酸发生反应，反应主要在T上，C上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含6～12个碳原子，用以减少探针杂交时的空间位阻。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到pg水平，可用于外源基因的检测。最近出现了一种新的光敏活性DNA生物素试剂，即生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）。BPA的DNA结合部分是一个活性糖香豆素衍生物，在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。 2．酶促生物素标记核酸　以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应32P标记的脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物素标记DNA的方法有缺口平移法和随机引物延伸法。 3．寡核苷酸的生物素末端标记　有5’-磷酸的化学标记法和3’-OH的酶促标记法。前者将寡核苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。后者是用末端转移将Bio-11–dUTP加于其3’-OH端（脱去一个焦磷酸）。 4．酶标DNA　标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。 5．酶标寡核苷酸　包括核苷酸5’末端标记HRP法和内部标记AP法。前者是在HRP中产生一个-HS反应基团，在寡核苷酸合成终了加在5’端，带一个C6的-HS基，与活化的HRP反应生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸过程中将一个5’带连接臂及CF3基团的尿苷3’亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP反应即得到AP标记的寡核苷酸。 6．DNA半抗原标记　其原理与Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黄甙代替生物素形成Dig –11- dUTP，酶促掺入DNA分子。用抗毛地黄甙抗体检测标记在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛）