二、双标记免疫荧光染色

抗体产生细胞胞浆内含有相对多的抗原，故采用直接或间接法免疫细胞化学技术可简化步骤，节　省时间，降低成本。为了清除组织间弥散的免疫球蛋白，我们在固定前用PBS浸洗，取得良好的效果。用双标记免疫荧光技术可以在同一张切片上显示出两种不同的抗体产生细胞。 1．组织加工根据研究目的的内窥镜直视下钳取胃、小肠或结肠粘膜。将取得的组织立即放入含4[SB]℃[/SB]，pH7.2、0.01mol/l PBS烧杯内搅拌10～18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃环境下继续脱水和透明，56℃浸蜡和包埋，石蜡块冰箱保存。组织切片后，37℃温水展平，载片后干燥，装干燥盒置于冰箱，可以保存1周左右。4[SB]℃[/SB]脱蜡和脱二甲苯，PBS洗涤后蒸馏水清洗，风干待染。 2．荧光素标记抗体　 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate, FITC）标记抗体的具体步骤详见第三章　。在标记络丹明B200（lissamine rhodamin B200,RB200）时应注意： （1）PCI[XB]5[/XB]极易吸收水份放出烟雾样刺激气体，RB200和丙酮混合后搅拌时也放出有毒的SO[XB]2[/XB]Cl刺激性气体，故操作时最好在通风橱内进行。在室外操作时应戴口罩。 （2）丙酮极易挥发，一定要在密闭容器（如带盖的青霉素瓶）内搅拌。吸取丙酮时也要动作迅速。 （3）在标记过程中，RB200能产生HCl，容易使蛋白变性，必须用较多碱性缓冲液中和。具体步骤是： ①按50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI[XB]5[/XB]的比例分别准确称取PCl[XB]5[/XB]和RB200，放入青霉瓶内。经橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。 ②用吸管吸取0.5ml左右丙酮迅速注入瓶内，继续搅拌5min形成紫褐色溶液（A液）。 ③1份抗血清（含蛋白10～20mg/ml）用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸缓冲液稀释后在4[SB]℃[/SB]冰箱内用磁力搅拌器边搅边加入A液，并用混合液反复冲洗青霉素瓶内的A液，直至干净为止，然后继续搅拌30～60min。 ④称取相当于蛋白半量的活性碳加入混合液内继续搅拌60min后，以4000r/min离心30min除去活性碳。 ⑤用30%～50%饱和硫酸铵盐析1次，去上清液，沉淀物用少量PBS溶解，过G-25层析柱去除硫酸铵即得RB200标记的抗体。 ⑥RB200的最大吸收光谱为570。用分光光度计分别测定570nm（RB200）和280nm（蛋白）的读数，根据Wells表算出F/P克分子比值。 ⑦效价高的标记抗体加0.1% NaN[XB]3[/XB]或硫柳汞（0.1%）数滴防腐，分装放置20℃以下可长期保存，4℃～10[SB]℃[/SB]能保存半年左右。 3．染色步骤染色前进行对照试验、吸收试验和抑制试验，测定抗体的纯度和特异性，同时以琼脂扩散和染色效果确定工作效价。在连续切片中，用RB200标记的IgG稀释液分别与FITC标记的IgA和IgM混合（根据染色效价，分别以对方为稀释液）进行染色。在37℃温盒内孵育45min，PBS清洗，过一次蒸馏水后风干，50%缓冲甘油封片，在冰箱中可保存10天左右。 4．阳性结果观察及细胞计数用Olympus荧光显微镜观察。选择BG[XB]12[/XB]激发滤板和0515抑制滤板可同时观察两种荧光。胞浆丰富、明显绿色荧光、核不着色的细胞为IgA或IgM产生细胞；胞浆红色荧光者为IgG产生细胞。少数胞浆黄色荧光的细胞核呈圆形，位于细胞中央，可能这些B淋巴母细胞能产生两种抗体，也可能是具有共同的轻链而引起的交叉反应。如果用α、β、γ、μ、δ等重链单抗进行研究，可以进行鉴别。在荧光显微镜下数出组织切片中阳性细胞总数（N），测微器放在目镜下测出组织切片所占小方格数（P）。测微器小方格边长为0.5mm,根据物镜放大倍数（4倍）用公式D=64N/P计算出每平方毫米组织切片中所含细胞数。