三、冷冻蚀刻免疫电镜技术

冷冻蚀刻法(Freeze Ftching),也称冷冻复型法(Freeze Replica)或冷冻切断(Freeze Fracture),是研究生物膜结构的重要方法之一。其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻,然后放到真空喷镀仪中切断,切断后的切面上有细胞器,其间还有冻成洋的水分。再加热使冰升华,将水份蒸发,把细胞器的膜结构暴露出来,这一步骤就称为冷冻蚀刻。如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结构上喷镀铂—碳投影,再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜。在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取出样品,把复型膜下面的组织腐蚀掉,再把复型膜捞在铜网上,在透射电镜下观察复型膜。 关于生物膜的分子结构,目前被大家公认的并为冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型(图7-1),即脂质—球状蛋白质镶嵌模型。依照这上模型学说表明,生物膜是一种流动 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan040.jpg[alt]生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解 [/alt][/img] 图7-1 生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解 的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜;脂质双分子层中每一分子分别具有两极,一端为亲水极,朝向膜的内、外表面,而另一端的疏水极朝向膜的中线部位,两排分子彼此相对,构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种,前者大约占蛋白质总量的3/4左右,外形近似球状,镶嵌在脂质分子层的不同深度内,而后者则大多附着于细胞膜的胞质面。在冷冻劈裂后,生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极。因此,膜的亲水部,分别命名为PS(与细胞质,核质或线粒体内基质相邻的面)和ES(与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面,如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做EF(面向细胞质、核质、或线粒体基质的面)和PF(向细胞外间隙或内间隙的面)。从70年代初期开始,冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用,但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行,所以仅能标记细胞外表面(ES)。80年代开始建立了断裂—标记细胞化学方法,将细胞膜劈开后,中央的两侧断面(EF与PF)以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标记,为此技术的广泛应用创造了条件。应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。