（三）扫描免疫电镜的具体操作步骤

1．标本处理 （1）细胞悬液：用10ml PBS 内含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa ）悬浮细胞，离心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至10[SB]5[/SB][SB]～[/SB]10[SB]6[/SB]细胞/ml，振摇成单细胞悬液。BSA能减低生物标本的非特异性吸附，但注意浓度应适宜，过高会减弱特异性反应。 （2）细胞附着于固体支持物：由于固定与免疫标记的孵育过程会引起细胞凝集，妨碍细胞表面的暴露，而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变。因此，通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或涂有带正电荷聚合物的盖玻片上，在粘附之前可依（1）法清洗标本，以除去细胞表面的附着物。固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜的载片或直径13nm、孔径0.22或0.45μm的过滤膜，载片制备方法：多聚—L—赖氨酸（Sigma）100μg/ml重蒸溶解涂抹于载片上，4[SB]℃[/SB]30min后倾倒掉表面液体，令其自然干燥。注意载玻片事先需要清洁液浸泡，水漂洗过夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用绸巾拭干。将细胞悬液（如细胞数少可事先离心，取沉淀细胞），滴于滤膜或载片上，由于多聚赖氨酸的粘附性，在固定及免疫标记过程中细胞不至于脱落。但注意勿使细胞干燥。 （3）组织切片与固体组织：组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡，由二甲苯经梯度酒精至水。组织切片与固体组织（勿过大）均应以PBS—BSA冲洗，并保持湿润避免干燥。 2．固定 （1）固定前用PBS—BSA冲洗5min×3。 （2）选择加入适合的固定剂；可为4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸缓冲液中。室温固定10～60min，或4[SB]℃[/SB]30～120min。 （3）PBS—BSA冲洗5min×3。 （4）除去残留的自由醛基，选以下任一方法： ①0.5mg硼氢化钠/1ml PBS 10min（新鲜配制） ②0.05～0.2mol/l 甘氨醊或赖氨酸—HCl/PBs 30～60min。 ③0.1～0.5mol/L氯化钠/PBs 30～60min。 ④PBS—BSA冲洗5min×3。 3．免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。 免疫金银染色法举例（张留保等，1997） （1）血细胞以PBS—BSA冲洗5min×3。 （2）2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4[SB]℃[/SB]，1h （3）PBS或TBS反复冲洗5min×3。 （4）胶体金免疫标记程序（略） （5）暗室显影液显影 （6）扫描电镜样品制样 （7）观察 作者在血细胞膜外显示了密集的金银粒标记（特异性标记膜的谷胱甘肽过氧化物酶及激素肽）。 4．常规扫描电镜标本处理 （1）PBS—BSA冲洗5min×3。 （2）后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液，时间视样本大小而定，一般室温30min左右。 （3）PBS—BSA洗5min×3。 （4）1%四氧化锇后固定1～2h （5）系列梯度乙醇或丙酮脱水 （6）临界点干燥或冰冻干燥 （7）喷镀碳与金 （8）扫描电镜观察