一、凝集素电镜标记技术

凝集素的特性及标记原理详见第五章　，近年来，凝集素电镜标记技术应用日益广泛，且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多，常用的有凝集素—酶（常用为HRP）、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术（包埋前染色）简介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987）。 （1）固定：常用为PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织，可将已藻注动物在4[SB]℃[/SB]过夜，次日取脑组织置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸钠缓冲液（含7.5%蔗糖）中漂洗。 （2）振动切片机（Vibratome）切60μm的厚片。 （3）切片孵育在PBS（内含0.1mol/l CaCl[XB]2[/XB][XB]、[/XB]Mgcl[XB]2[/XB]和MnCl[XB]2[/XB]）10min（有作者主张此步可省略）。 （4）为增强细胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl[XB]2[/XB]水溶液中，pH7.8,37[SB]℃[/SB]孵育30min。 （5）PBS洗3次，每次2min。 （6）凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100）4℃过夜，最好不断轻轻振荡。 （7）PBS洗3次，每次2min。 （8）DAB-H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]显色。 （9）1%O[XB]S[/XB]O[XB]4[/XB]水溶液固定。 （10）系列酒精脱水，EPON包埋，切片。 （11）电镜沿—铀双染观察。 凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上，易与电子染色相区别。