四、免疫电镜金—银法染色技术

关于免疫金银细胞化学的原理、试剂配制和光镜显示技术在本书第五章　已作了较详尽的叙述。免疫金银细胞化学技术说可应用于电镜水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步骤如下： （1）组织固定振动切片机切片10～30μm。 （2）人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封闭非特异性结合部位 （3）1%硼氢化钠的PBS孵育30min。 （4）一抗37℃，2h。 （5）PBS含0.1%BSA pH7.4 冲洗3min×3次。 （6）PBS含0.1%BSA pH8.2 冲洗3min×3次。 （7）人10～15nm金标羊抗兔抗血清，工作浓度约1：10，37℃孵育45min。 （8）硝酸银液物理显影（详见第五章　第六节　）。 （9）在解剖显微镜下取免疫反应阳性部位，人1%锇酸后固定20min，常规脱水，树脂包埋。 （10）超薄切片机切0.1μm左右半薄切片,定位阳性反应部位,制超薄切片。如有暗视野微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位，微镜则更有助于定位。在暗视野前景下，金银粒呈金黄色闪光颗粒，即使微量金银也可定位。 （11）铀—铅电镜染色，电镜观察。 免疫金银法敏感度高，金银颗粒电子密度高，反差强；应用包埋前染色可先定位阳性反应部位再作电镜超薄切片，获得阳性反应机率高，特别适用于含微量抗原的部位，如突触等。其不足是须经暗室显影，手续较烦杂，包埋前免疫染色易增加非特异性染色。另外，由于单个金粒周围结合的银粒不是固定的，受多种因素影响。因此，电镜免疫金粒染色法的金粒银粒计算不适于做半定量观察，误差较大。