二、限制酶切片段长度多态性组织配型法

迄今，一直是血清学和细胞学方法进行HLA抗原结构分析，最近已开始应用分子生物学基因克隆技术进行HLA定型。由于人们已常握了HLA共同和特异的抗原的核苷酸序列，才有可能用此新方法进行组织配型检验。 限制酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）组织配型技术的原理是目前已掌握了编码HLA抗原的核苷酸序列，包括各等位基因共有的和专有的序列。HLA-A、-B、-C位点的Ⅰ类重链基因的核苷酸序列有高度同源性，由这些基因片段克隆可得HLAⅠ类专用的探针，因为检测HLAⅠ类抗原序列的标志，目前也已得到Ⅱ类抗原特异的探针。由于HLA等位基因的多态性是表现在其核苷酸序列的差异上，由这些基因中克隆出的特异DNA片段，就可检测这些基因的差别。由于核苷酸序列不同，被限制性内切酶作用部位（切点）也不同，这种酶切点只有4～6个核苷酸长度。因此来源于不同HLA单倍型的DNA可被一种内切酶切成不同长度的片段。在实际工作中，从细胞中提取基因组DNA（genomic DNA）的多态性比实际HLA-Ⅱ类抗原的多态性还要复杂，因为基因的内含子（不转录基因）序列不同，和外显子（转录并翻译成蛋白质）序列差别均在酶切后的细胞总DNA中。 RFLP组织配型检测主要包括4个步聚（印迹）：①提取细胞总DNA，用限制性内切酶消化；②凝胶电泳；③将凝胶中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上；④经变性处理后用同位素标记的探针进行分子杂交。经放射自显影，得到显影带（bands）。即可得知分子量大小不同的DNA片段（图20-9）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/yixuemianyixue/yixuemianyixue092.jpg[alt]用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型[/alt][/img] 图20－9用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型 RFLP组织配型实验是用于血清学或细胞学检测失败的样品，如HLA抗原不表达（裸细胞）细胞脆性大而破碎，淋巴细胞减少没有足够的样品时。由于分子生物学方法采样少、特异、敏感的优点可弥补常规方法的不足。此外，RFLP组织配型法还可查出DNA变异及基因重组的情况，而血清学方法则不能。PFLP组织配型为器官移植、骨髓移植选择适宜的供体，用比较供体，受体限制酶切片段的长度的差异。两者的RFLP越接近。差别越小，移植效果越好，近年来发展的PCR-RFLP以其简单、敏感、可靠、价廉且无需同位素等优点，已取代了RELP法。