猪胃螺杆样细菌与幽门螺杆菌的比较研究

1983年,Warren和Marshall在患慢性胃炎和消化性溃疡病人的胃粘膜中发现一种弯曲状细菌。现称之为幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori, Hp）。此后，各国学者相继进行了大量的研究。证明幽门螺杆菌很可能是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病菌。据报道幽门螺杆菌感染悉生仔猪获得成功，表明猪可能是一种敏感动物。那么，在自然条件下，猪是否有幽门螺杆菌的感染并并发胃粘膜的病变呢？为此我们对正常猪胃做了微生物学和病理组织学检查。结果发现在猪胃粘膜中存在有螺杆菌样细菌（Heliocbacter-like organisms,HlO）其形态和某些生物学性状与幽门螺杆菌基本相同，而且HLO阳性的猪胃粘膜，呈现与人慢性胃炎相似的病理变化，现将结果报道如下。 [b]1 材料和方法[/b] 1.1 标本来源 猪胃10个,从北京沙河肉联厂新屠宰的健康猪中随机取出,有70%酒精消毒后沿胃大弯剪开,清除内容物用无菌操作分别从胃窦、胃底和胃体部剪取胃粘膜组织各4块，其中2块用缓冲的10%福尔马林固定，供病理学研究，另2块组织供细菌培养用。 1.2 螺杆菌培养 将从胃窦、胃底和胃体部取得的粘膜组织，分别置于无菌玻璃研磨器中，加0.5ml含10%小牛血清的布氏肉汤，研磨成匀浆后，取0.1ml接种于含6%羊血的布氏培养基平板中，放置于混合气体（10%CO2，5%O2，85%N2）培养72h后观察结果。另取胃粘膜匀浆一小滴于载玻片上，推片凉干用甲醇固定，0.3%复红染色后，直接镜检。 1.3 全菌蛋白电泳分析 用SDSPAGE技术，对幽门螺杆菌（菌株号为NCTC14126，CAPM00112-5），空肠弯曲菌（菌株号为Cj22，Cj26，流G15），结肠弯曲菌（菌株号CC29）和分离到的猪胃螺杆菌作了全菌蛋白电泳图谱的比较。实验条件为浓缩胶5%，分离胶11%，各菌体蛋白样品20μl+2×buffer20μl 100°C水浴5min且加样，50V恒压2h时，75V恒压12h，考马斯亮蓝R-250染色。 1.4 药敏试验 抗菌药物敏感试验所用试纸，系由大连生物试剂厂生产，被试菌株为猪胃螺杆样菌37°C48h培养物，用0.1%胨生理盐水洗下，制成2×10[SB]9[/SB]cfu/ml菌液，取0.1ml菌液均匀涂于布氏培养基表面贴药敏试纸7张，然后置于混合气体培养箱中，孵育48h～72h，测量抑菌圈直径。 1.5 病理学检查 经福尔马林固定的组织标本，用石蜡包埋作5μ厚度的切片，每个标本4张。2张用苏木素一伊红染色，作病理组织学观察；另2张用Warthin-Stsrry镀银染色，检查弯曲菌。 [b]2 结果[/b] 2.1 猪胃螺杆样菌的分离 在10例猪胃标本中，有8例分离到HLO。若按不同部位猪胃粘膜的分离阳性率来看，以胃底部为最高（8/10），其次为胃窦部（4/10），胃体部最低（3/10），结果见表1。猪胃HLO的菌落较小，约0.5mm～1mm直径，呈圆形、扁平、湿润、半透明，偶或可见菌落周围有β微溶血。菌体较纤细着色良好，呈弧形，S形或海鸥展翅状。其中第5例标本，除典型的弯曲菌外，还发现一种螺旋状菌，该菌螺旋较致密，螺旋数由数个至十数个不等，其形态与从猫中分离的螺旋菌十分相似。 2.2 幽门螺杆菌与猪胃螺旋杆菌的生化特性 我们将分离到的猪胃HLO，包括致密螺旋菌与幽门螺杆菌做了生化特性的比较，结果见表2。如表2所示，猪胃HLO，除尿素酶试验较迟缓外，其他各项生化反应均与幽门螺杆菌一致，而猪胃致密螺旋菌除尿素酶试验较迟缓外，H2S产生为阴性。 2.3 全菌蛋白的电泳图谱分析 两株幽门螺杆菌（NCT11637，CAPM112）的电泳电谱相似；空肠弯曲菌（Cj22,Cj26,流G15）和结肠弯曲菌（CC29）的图谱相似；各株猪胃HLO（6B，6C，7B，7C，10B，10C）之间的图谱亦相似，但明显不同于Hp与空肠弯曲菌的图谱。从同一动物不同部位分离的猪胃HLO，其图谱相同，而从不同动物分离的猪胃HLO，其全菌蛋白图谱有微细的差别。 2.4 药敏试验 猪胃HLO（1a,9a）的药敏试验结果表明，这些菌株对呋喃唑酮、红霉素、氯霉素和庆大霉素均敏感，而对羟氨苄青霉素、先锋霉素、萘啶酮酸等耐药。 2.5 病理组织学研究 在10例猪胃标本的组织切片中，有7例检查到螺杆样细菌（表1），这些细菌往往成群或散在地存在于粘液层，粘膜上皮表面或粘膜腺体内。这些细菌，有的呈弧形，有的呈S形，其形态与在慢性胃炎病人胃粘膜中所见到的幽门螺杆菌十分相似。这7例细菌阳性的胃粘膜组织都呈现中等度到较严重的慢性炎症病灶，主要表现为粘膜和固有层大量的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润，间或有少量嗜伊红细胞和多形核白细胞浸润。有些病灶伴有淋巴滤泡形成。有意义的是这些病变，只见窦部和底部的粘膜而胃体部组织则无一例出现上述病变（表1）。 表1 猪胃粘膜HLO培养和病理组织检查结果

标本编号	胃粘膜肉眼观察	HLO培养结果			慢性炎症病变			组织切片检检菌
		胃底	胃窦	胃体	胃底	胃窦	胃体
1	正常	+	－	－	+	+	－	+
2	正常	－	－	－	－	－	－	－
3	正常	+	－	－	+	+	－	+
4	正常	+	+	－	+	+	－	+
5	正常	+	－	－	+	+	－	+
6	充血，点状出血	+	+	+	+	+	―	+
7	充血，点状出血	+	+	+	+	+	―	+
8	正常	－	－	－	－	－	―	―
9	正常	+	－	－	－	－	－	－
10	正常	+	+	+	+	+	－	+

表2 幽门螺杆菌与猪胃中HLO的生化反应比较

菌 株	氧化酶	过氧化氢酶	葡萄糖发酵	H2S产生	马尿酸水解	0.5% NaCl	0.5% NaCl	尿素酶试验
幽门螺杆菌NCTC11673	+	+	－	+	－	+	－	+（4h）
猪胃弯曲菌7a	+	+	－	+	－	+	－	+(36h)
猪胃密螺旋菌WL5a	+	+	－	－	－	+	－	+(24h)

[b]3 讨论[/b] 在某些哺乳动物的胃粘膜中，也曾发现有幽门螺杆菌样细菌，但除雪貂外，一般不引起病变。我们从在自然条件下生长的普通猪胃中分离到螺杆菌样细菌，而且阳性率相当高（80%）。猪胃HLO的菌落和菌体形态与Hp十分相似，某些生化反应特性两者形态也基本一致，但HLO的尿素酶活性较低。SDS-PAGE全菌蛋白图谱表现猪胃HOLO和Hp的图谱差别也较明显。两者的种属关系如何有待进一步研究。在HLO培养阳性的8例猪胃中，有7例在其组织切片中发现为数较多的HLO，同时伴有慢性胃炎病变。就其病变的性质而言，与人的慢性胃炎基本相同，但是，其发生病变的范围较广，累及窦部和底部，而与Hp感染相关的人的慢性胃炎，多发生于窦部，正常猪出现胃炎病变，看来产不少见，例如Kathryn在其作为对照组的某些猪的胃组织中曾观察到慢性炎症病变，对此作者未作解释。猪的胃肠系统在解剖学和生理学上类似于人类，而且近来在人和猪的胃组织中均检查到甘油脂（glycero lipid），后者被认为是胃粘膜上的幽门螺杆菌的受体。 综上所述，我们认为猪胃HLO与猪慢性胃炎的关系，犹如Hp与人慢性炎的关系。在Hp不易感染其他动物的情况下，研究HLO对猪慢性胃炎的致病作用，或将有助于阐明Hp对慢性胃炎和消化性溃疡的致病机理。鉴于猪能自然感染螺杆菌样细菌并有慢性胃炎，因此用猪做幽门螺杆菌感染试验，在分析结果时应审慎。