一、时间分辨荧光免疫测定

以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、仪器组件等的本底荧光干扰，以及激发光源的杂射光的影响，使灵敏度受到很大限制。时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。其基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。TR-FIA的测定原理见图17-4。以双抗体夹心法为例的测定反应程序见图17-5。其中增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应完成后，生成的抗原－抗体－铕标记物复合物在弱碱性溶液中，经激发后所产生的荧光信号甚弱。在增强液中可至pH2～3，铕离子很容易解离出来，并与增强液中的β-二酮体生成带有强烈荧光的新的铕螯合物，大大有利于荧光测量。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan106.jpg[alt]TR-FIA测定原理示意图[/alt][/img] 图17-4 TR-FIA测定原理示意图 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan107.jpg[alt]双抗体夹心法TR-FIA反应程序示意图[/alt][/img] 图17-5 双抗体夹心法TR-FIA反应程序示意图 所用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000次的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长镧系荧光。检测灵敏度可达0.2～1ng/ml。