二、最适工作浓度的选择
在建立某一ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。
[b]（一）间接法测抗体[/b]
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。
（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。
（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸亮度（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。
2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度
（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。
（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。
（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。
表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择
| 各类血清 | 抗原稀释度 |
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | |
| 强阳性 | 1.20 | 1.04 | 0.84 | 0.68 | 0.42 |
| 弱阳性 | 0.64 | 0.41 | 0.30 | 0.22 | 0.19 |
| 阴性 | 0.23 | 0.13 | 0.08 | 0.66 | 0.05 |
| 稀释液 | 0.09 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.04 |
[b]（二）夹心法测抗原[/b]
在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：
表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
| 包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度 | 参考抗原 |
| 强阳性（25ng/ml） | 弱阳性（1.5ng/ml） | 阴性 |
| 10μg/ml | | | |
| 1:1000 | 1.17 | 0.15 | 0.09 |
| 1:5000 | 0.46 | 0.03 | 0 |
| 1:25000 | 0.12 | 0 | 0 |
| 1μg/ml | | | |
| 1:1000 | ＞2 | 0.25 | 0.10 |
| 1:5000 | 0.91 | 0.12 | 0.01 |
| 1:25000 | 0.25 | 0.01 | 0 |
| 0.1μg/ml | | | |
| 1:1000 | 0.42 | 0.13 | 0.13 |
| 1:5000 | 0.11 | 0.03 | 0.02 |
| 1:25000 | 0.03 | 0 | 0 |
（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。
（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。
（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。
（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。
（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。
