二、最适工作浓度的选择

在建立某一ELISA测定中,应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择,以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例,介绍最适工作浓度的选择方法。 [b](一)间接法测抗体[/b] 1.酶标抗抗体工作浓度的选择 (1)用100ng/ml人IgG进行包被,洗涤。 (2)将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中,保温、洗涤。 (3)加底物显色。加酸终止反应后,读取吸亮度(A),绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度,作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。 2.棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度 (1)用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被,洗涤。 (2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释,加样,保温,洗涤。 (3)加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体,保温,洗涤。 (4)加底物显色。加酸终止反应后读取A值。 (5)选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果,表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。 表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择
各类血清抗原稀释度
1:501:1001:2001:4001:800 
强阳性1.201.040.840.680.42
弱阳性0.640.410.300.220.19
阴性0.230.130.080.660.05
稀释液0.090.020.020.020.04
[b](二)夹心法测抗原[/b] 在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,举例如下(表15-2): 表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度参考抗原
强阳性(25ng/ml)弱阳性(1.5ng/ml)阴性
10μg/ml   
1:10001.170.150.09
1:50000.460.030
1:250000.1200
1μg/ml   
1:1000>20.250.10
1:50000.910.120.01
1:250000.250.010
0.1μg/ml   
1:10000.420.130.13
1:50000.110.030.02
1:250000.0300
(1)抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml,分别在ELISA板上进行包被,每一浓度包括三个纵行,洗涤。 (2)在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另一横行加入弱阳性抗原液,第三横行加入阴性对照液,保温,洗涤。 (3)将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度,例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中,保温,洗涤。 (4)加底物显色。加酸终止反应后,读取A值。 (5)以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件,据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml,酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再做进一步的棋盘滴定。