二、最适工作浓度的选择
在建立某一ELISA测定中,应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择,以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例,介绍最适工作浓度的选择方法。
[b](一)间接法测抗体[/b]
1.酶标抗抗体工作浓度的选择
(1)用100ng/ml人IgG进行包被,洗涤。
(2)将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中,保温、洗涤。
(3)加底物显色。加酸终止反应后,读取吸亮度(A),绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度,作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。
2.棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度
(1)用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被,洗涤。
(2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释,加样,保温,洗涤。
(3)加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体,保温,洗涤。
(4)加底物显色。加酸终止反应后读取A值。
(5)选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果,表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。
表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择
各类血清 | 抗原稀释度 |
1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | |
强阳性 | 1.20 | 1.04 | 0.84 | 0.68 | 0.42 |
弱阳性 | 0.64 | 0.41 | 0.30 | 0.22 | 0.19 |
阴性 | 0.23 | 0.13 | 0.08 | 0.66 | 0.05 |
稀释液 | 0.09 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.04 |
[b](二)夹心法测抗原[/b]
在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,举例如下(表15-2):
表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度 | 参考抗原 |
强阳性(25ng/ml) | 弱阳性(1.5ng/ml) | 阴性 |
10μg/ml | | | |
1:1000 | 1.17 | 0.15 | 0.09 |
1:5000 | 0.46 | 0.03 | 0 |
1:25000 | 0.12 | 0 | 0 |
1μg/ml | | | |
1:1000 | >2 | 0.25 | 0.10 |
1:5000 | 0.91 | 0.12 | 0.01 |
1:25000 | 0.25 | 0.01 | 0 |
0.1μg/ml | | | |
1:1000 | 0.42 | 0.13 | 0.13 |
1:5000 | 0.11 | 0.03 | 0.02 |
1:25000 | 0.03 | 0 | 0 |
(1)抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml,分别在ELISA板上进行包被,每一浓度包括三个纵行,洗涤。
(2)在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另一横行加入弱阳性抗原液,第三横行加入阴性对照液,保温,洗涤。
(3)将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度,例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中,保温,洗涤。
(4)加底物显色。加酸终止反应后,读取A值。
(5)以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件,据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml,酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再做进一步的棋盘滴定。