二、试验方法

补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 [b]（一）试剂[/b] 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。 2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位（1:64～1:32），抗体采用4个单位（1:8）。 表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原	抗血清稀释倍数								抗原对照
1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512
1:4	4	4	4	4	4	4	3	2	0
1:8	4	4	4	4	4	3	2	1	0
1:16	4	4	4	4	3	2	2	±	0
1:32	4	4	4	4	3	1	±	0	0
1:64	4	4	4	④	2	±	0	0	0
1:128	4	2	1	0	0	0	0	0	0
1:256	3	1	0	0	0	0	0	0	0
1:512	0	0	0	0	0	0	0	0	0
抗体对照	0	0	0	0	0	0	0	0

注：1、2、3、4分别表示溶血反应强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。 3．补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X计算，X＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。 表14-5补体的滴定

管号	1:60补体（ml）	缓冲液（ml）	稀释抗原（ml）		致敏SRBC （ml）		结果
1	0.04	0.26	0.1	放 置 37℃水 浴30min	0.2	放 置 37℃水 浴30min	不溶血
2	0.06	0.24	0.1		0.2		不溶血
3	0.08	0.22	0.1		0.2		微溶血
4	0.10	0.20	0.1		0.2		微溶血
5	0.12	0.18	0.1		0.2		全溶血
6	0.14	0.16	0.1		0.2		全溶血

[b]（二）血清标本[/b] 采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。血清在试验前应先加热56℃30min（或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：①加热提高12；②－20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/L盐酸处理；④加入少量补体后再加热灭活；⑤以白陶土处理；⑥通入CO[XB]2[/XB]；⑦以小白鼠肝粉处理；⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。 [b]（三）正式试验[/b] 以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶，1U为全溶略带有少许红细胞，0.5U应不溶。如0.5U补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2U对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。 表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序

反应物（ml）	待检血清管		阳性对照管		阴性对照管		抗原对照管	补体对照管			红细胞对照管
测定	对照	测定	对照	测定	对照	2U		1U	0.5U
稀释血清	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	－	－	－	－	－
抗原	0.1	－	0.1	－	0.1	－	0.1	0.1	0.1	0.1	－
缓冲液	－	0.1	－	0.1	－	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.4
2U补体	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	－	－	－
1U补体	－	－	－	－	－	－	－	－	0.2	－	－
0.5U补体	－	－	－	－	－	－	－	－	－	0.2	－
混匀，置37℃1h或4℃16～18h
致敏红细胞	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
混匀，置37℃30min后观察结果