一、单向扩散试验

本试验是在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形成可分为试管法和平板法两种。 [b]（一）试管法[/b] 该方法由Oudin于1946年报道。将血清或纯化抗体混入约50℃的0.7％琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在凝胶中面加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环。在黑色背景斜射光处，极易观察这种白色不透明沉淀带。 沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或者抗体量多；反之，下面的沉淀带则是抗原量大，抗体量少。另外，抗体类型也有很大区别，如用兔抗血清（R型抗体），抗体过量亦可形成复合物，因而沉淀带宽而界线不清；如用马抗血清（H型抗体），抗原或抗体过量皆不形成复合物，因而只在比例合适处形成界线清晰的沉淀物（图12-1）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan048.jpg[alt]两种抗血清形成的沉淀带示意图[/alt][/img] 图12-1两种抗血清形成的沉淀带示意图 [b]（二）平板法[/b] 此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：将抗体或抗血清混入0.9％琼脂糖内（约50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般直径约3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37℃让其向四周扩散，24～48h后可见周围出现沉淀环（图12-2）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan049.jpg[alt]单向辐射状免疫扩散[/alt][/img] 图12-2单向辐射状免疫扩散 上排为5个不同的参考中、下排为患者血清 下排右2为一异常病理血清 由于试验中抗原向四周扩散，故又称单向辐射状免疫扩散（singleradialimmunodeffusion，SRID）。最后，测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀还与分子量和抗散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法： 1．Mancini曲线适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48h）的结果处理。使用方格计算纸划线，扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系（图12-3）。 利用公式表示：C/d[SB]2[/SB]＝K [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan050.jpg[alt]Mancini曲线[/alt][/img] 图12-3Mancini曲线 T[XB]1[/XB]为1624h；T[XB]2[/XB]为24～48h；T[XB]3[/XB]为48h以上；可见T[XB]3[/XB]为直线，T[XB]1[/XB]为反抛物线 式中C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数。 2．Fahey曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。使用半对数划线，浓度的对数与扩散圈直径之间呈线性关系（图12-4）。 用公式表示：log/d＝K 式中C＝抗原浓度（mg/d），d＝沉淀环直径，K＝发常数。 各种蛋白质只要符合以下3条，几乎皆可用SRID定量测定：①备有仅对某待测抗原的单价特异抗血清；②备有已知含量的标准品；③待测品含量在1.25μg/ml以上（单向扩散技术的敏感度）。现在最常用于临床检测的项目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白。 在检测标本的同时，用已知含量的标准抗原作5～7个稀释度，同时测量圈的大小（见图12-2）。按扩散时间（Fahey和Mancini法）的不同，取方格纸或对数纸做标准曲线图。 单向琼脂免疫扩散法作为抗原的定量方法，其重复性和线性皆是可信赖的，唯敏感度稍差（不能测μg/ml以下含量）。另外，以下影响因素也应注意。 1．抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。 2．标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。 3．测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。 4．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应，就形成内外两重环（图12－2）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/mianyixuehemianyixuejianyan/mianyixuehemianyixuejianyan051.jpg[alt]Fahey曲线[/alt][/img] 图12-4Fahey曲线 t[XB]1[/XB]为1624h；t[XB]2[/XB]为2448h；t[XB]3[/XB]为48h以上可见t[XB]1[/XB]为直线，t[XB]3[/XB]为抛物线 5．在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，这主要出现在Ig测定中。如用单向克隆抗体或用骨髓抗原免疫动物获得的抗血清，都存在结合价单一的现象，若用此作为单向扩散试剂测量正常人的多态性抗原，则抗体相对过剩，使沉淀圈直径变小，测量值降低。 6．测得结果的假阳性升高现象与上面相反，如用多克隆抗体测定单克隆病（M蛋白），则抗原相对过剩（单一抗原决定簇成分），致使沉淀圈呈不相关的扩大，从而造成某一成分的伪性增加。