伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗制造及检定规程
本品系用伤寒、副伤寒甲、乙菌分别培育，取菌苔制成悬液经甲醛杀菌，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每ml含伤寒菌1.5亿、副伤寒甲、乙菌各0.75亿制成。用于预防伤寒及副伤寒甲、乙。
[b]1 菌种[/b]
1.1菌种来源
制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗用的菌种及检定菌种用的各种诊断血清，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。
1.2 菌种检定
检定菌种可用pH7.2～7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基。
1.2.1 培养特性
各菌株应具有典型的形态、培养及生化特性。
1.2.2 血清凝集试验
用37℃培育18～20小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成含菌6亿/ml，与相应的伤寒、副伤寒甲、乙菌诊断血清做定量凝集试验，摇匀后放37℃过夜，以肉眼可见到凝集（+）之血清最高稀释度为凝集反应之效价，凝集价不应低于血清原效价之半。伤寒菌种加用伤寒Vi及O血清做凝集试验，应与Vi血清有凝集，与O血清不凝集，或仅有较低凝集。
1.2.3 毒力试验
用37℃培育12～16小时的琼脂培养物以生理盐水稀释为下列浓度的菌液：
伤寒、副伤寒乙菌种：3亿/ml、1.5亿/ml及0.75/ml。
副伤寒甲菌种；15亿/ml、7.5亿/ml及3.75亿/ml。
根据菌种毒力情况稀释度可作更改，也可增加稀释度。
每一稀释度的菌悬液腹腔注射体重14～16g之小白鼠，至少5只，每只0.5ml，观察3天，使小白鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个致死量（LD），伤寒、副伤寒乙菌种1LD应不超过1.5亿菌，副伤寒甲不超过7.5亿菌。
1.2.4 毒性试验
用37℃培育18～20小时之琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，伤寒及副伤寒甲菌液加温56℃1小时，副伤寒乙菌液加温58℃1小时杀菌（或其他方法杀菌），不加防腐剂。杀菌试验合格后稀释为每ml含菌60、30及15亿等3个浓度，每一浓度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重15～18g小白鼠5只，观察3天，注射7.5亿菌之小白鼠应全部生存，注射15亿菌之5只小白鼠可有3只死亡。
1.2.5 免疫力试验
用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防腐剂的菌液稀释成如下的浓度：
伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。
副伤寒甲菌液：5亿/ml。
每一菌液免疫体重14～16g小白鼠至少30只，每只皮下注射上述浓度的菌液0.5ml。注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天进行毒菌攻击。每种死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相应毒菌（含于0.5ml中），同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小白鼠3组，每组至少5只作对照，分别于腹腔注射2、1及1/2LD的毒菌（各含于0.5ml中），观察3天。对照组小白鼠感染2及1LD者应全部死亡，感染1/2LD者要有部分死亡。伤寒、副伤寒乙菌液免疫组至少保护70%小白鼠活存，副伤寒甲菌液免疫组至少保护60%小白鼠活存，则免疫力试验为合格。
免疫力试验也可用LD50法判定结果：
用加温杀菌（或用其他方法杀菌）不加防腐剂的菌液稀释成如下的浓度：
伤寒及副伤寒乙菌液：2.5亿/ml。
副伤寒甲菌液：5亿/ml。
每一菌液免疫体重14～16g之小白鼠至少30只，每只皮下注射上述浓度的菌液0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后9～11天，用培养12～16小时的伤寒、副伤寒甲或乙菌株之菌苔以pH7.2～7.4的肉汤及生理盐水等稀释至适当的浓度进行攻击。免疫组小白鼠应感染100个LD[XB]50[/XB]以上的毒菌。同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小白鼠分为3～4组，每组至少5只，分别感染不同剂量毒菌作对照。免疫组及地照组分别腹腔注射0.5ml，观察3天，计算LD50。免疫组至少应保护70%小白鼠存活。
在做免疫力试验时，应以参考菌苗作对照。
1.2.6 抗原性试验
选体重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力试验所用之菌液静脉注射3次每次0.5ml，第1次注射7亿菌，第2次14亿菌，第3次21亿菌，每次间隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集试验测定效价。伤寒菌免疫的血清对免疫菌效价应不低于1∶12800，副伤寒甲、乙效价不低于1∶6400，2/3家兔血清之凝集价达上述要求即为合格。
1.3 菌种保存
菌种应冻干保存，冻干菌种保存于2～8℃。
菌种冻干后应抽取样品按1.2项进行检查，合格后可使用3年。以后每次生产前必须检查全部特性一次，合格者可继续使用2年。
[b]2 菌苗制造[/b]
制造伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗所用的每一菌种选用2个菌株。
2.1 菌种
冻干菌种启开后应检查菌形、纯度及进行玻片凝集试验（伤寒菌加用Vi血清），合格后即可使用。每启开1支冻干菌种用于生产不应超过6代。
2.2 制造用培养基
用pH7.2～7.4的马丁琼脂或肉汤琼脂或其他适宜的培养基。
2.3 原液制造
2.3.1 接种
采用涂种，接种后置37℃培育18～14小时。
2.3.2 采集
采集前逐瓶检查，有杂菌者废弃。刮取菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水中。
2.3.3 纯菌试验
原液采集后应逐瓶取样接种琼脂斜面1管，于37℃培育3天，24～26℃1天，有杂菌生长应废弃。
2.3.4 杀菌
原液用甲醛溶液杀菌，各种原液加入甲醛溶液浓度如下：
伤寒菌原液不超过1.1%±0.1%（ml /ml）。
副伤寒甲菌原液不超过1.4%±0.1%（ml /ml）。
副伤寒乙菌原液不超过1.8%±0.2%（ml /ml）。
加杀菌剂后的原液应放在37℃，不得超过7天，以后保存于2～8℃。
2.3.5无菌试验
纯菌试验合格的原液，应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基及普通琼脂斜面各1管，放37℃培育5天有本菌生长，可加倍量复试一次；有杂菌生长应废弃。
2.3.6 原液合并
无菌试验合格之原液，按不同菌株或不同制造日期分别过滤合并，合并后应加不超过0.5%（g /ml）的苯酚或其他适宜之防腐剂，保存于2～8℃。
2.4 原液检定
2.4.1 镜检
菌形应正常，无杂菌。
2.4.2 凝集试验
原液与相应血清进行凝集试验，其凝集效价不应低于血清原效价之半。
2.4.3无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.4.4 浓度测定
应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。
2.4.5 免疫力试验
原液于无菌试验合格后与质量检定部门会同进行。抽验批数应不少于生产批数的1/5。方法同1.2.5项，唯所用小白鼠每组至少15只。对伤寒或副伤寒甲乙毒菌之攻击，均应保护60%小白鼠活存为合格。
2.5 原液保存
原液应保存于2～8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀释时不得少于4个月，保存效期自采集之日起为2年半。
2.6 菌苗稀释
2.6.1 原液配合
稀释前应先将不同菌种所制之原液按比例配合。每一种菌所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下，允许两种菌之间在20%的范围内互有增减；同一种菌不同菌株之原液按等量混合，但每个菌株所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下，允许两个菌株之间在40%范围内互有增减。
2.6.2 菌苗稀释
稀释菌苗用含0.25%～0.5%（g /ml）苯酚或其他适宜的防腐剂之磷酸盐缓冲生理盐水。
2.6.3 苗菌浓度
菌苗每ml含伤寒菌1.5亿，副伤寒甲及副伤寒乙菌各0.75亿。
2.7 菌苗分批
同组配合的原液用同批稀释液在同一日稀释的种瓶菌苗为1批。大罐稀释时应按大罐分批，并按分装机分为亚批。
2.8 检定
稀释后每批应逐瓶抽样进行无菌试验及测定防腐剂含量（大罐稀释时除外）。
2.9 分装
分装后应每亚批抽样送质量检定部门进行成品检定。
[b]3 成品检定[/b]
3.1物理化学检查
菌苗应为乳白色悬液，pH值为6.8～7.4，不应有摇不散的菌块或异物。苯酚含量应为0.25%～0.5%（g /ml）。
3.2 菌形及纯度
染色镜检，应为革兰氏阴性杆菌。至少观察10个视野，平均每个视野内不得有10个以上非典型菌（线状、粗大或染色可疑杆菌），并不应有杂菌。
3.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.4 安全试验
3.4.1 毒性试验
用体重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用体重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗1.5ml，观察7日，应无死亡。
3.4.2 防腐剂试验
用体重18～20g之健康小白鼠2只，每只皮下注射菌苗0.5ml，用苯酚作防腐剂的菌苗注射的小白鼠可发生战栗症状，但不应超过半小时，观察7日不得有局部脓肿或死亡。
[b]4 保存与效期[/b]
应保存于2～8℃。自稀释之日起效期为1年半。如原液保存超过1年稀释，应相应缩短效期（自原液采集之日起总效期不得超过2年半）。
