伤寒、副伤寒甲二联菌苗制造及检定规程

本品系用伤寒、副伤寒甲菌培育后取菌苔制成悬液,加甲醛杀菌,以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成每ml含伤寒1.5亿菌,副伤寒甲1.5亿菌制成。用于预防伤寒、副伤寒甲。 [b]1 菌种[/b] 1.1 菌种来源 制造伤寒、副伤寒甲二联菌苗用的菌种及检定菌种用的诊断血清,应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2菌种检定 检定菌种可用pH7.2~7.4的肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜的培养基。 1.2.1培养特性 制造菌苗的菌株应具有的典型的形态、培养和生化特性。 1.2.2血清凝集试验 用37℃培养18~20小时的培养物以磷酸盐缓冲生理盐水稀释成含菌6亿/ml,与相应的伤寒、副伤寒甲菌诊断血清作定量凝集试验,摇匀后37℃过夜,以肉眼见到凝集(+)之血清最高稀释度为凝集反应之效价。凝集价不应低于血清原效价之半。并用伤寒Vi及O血清做凝集试验,应与Vi血清有凝集,与O血清不凝集,或仅有较低凝集。 1.2.3毒力试验 用37℃培育12~16小时的琼脂培养物以生理盐水稀释,伤寒稀释成6亿/ml、3亿/ml、1.5亿/ml及0.75亿/ml,副伤寒甲稀释成15亿/ml、7.5亿/ml及3.75亿/ml等浓度的菌液(根据菌种毒力情况可作更改也可增加稀释度)。 第一稀释度菌悬液腹腔注射体重14~16g小白鼠至少5只,每只0.5ml,观察3天,使小白鼠于感染后3天内全部死亡的最小剂量为1个致死量(LD),伤寒菌种1LD应不超过1.5亿菌,副伤寒甲菌种不超过7.5亿菌。 1.2.4毒性试验 用37℃培育18~20小时琼脂培养物混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内,56℃加温1小时(或其他方法杀菌),不加防腐剂。杀菌试验合格后稀释成每ml含菌60、30及15亿共3个浓度,每一浓度的菌悬液以0.5ml腹腔注射体重15~18g小白鼠5只,观察3天,注射7.5亿菌之小白鼠应全部生存,注射15亿菌的5只小白鼠可有3只死亡。 1.2.5免疫力试验 按《伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗制造及检定规程》1.2.5项进行。 1.2.6抗原性试验 选体重2kg左右之健康家兔至少3只,用免疫力试验所用之菌液静脉注射3次,每次0.5ml,第1次注射7亿菌,第2次14亿菌,第3次21亿菌,每次间隔7天。末次注射后10~14天采血做定量凝集试验测定效价。伤寒菌免疫的血清对免疫菌效价应不低于1∶12800,副伤寒甲效价不低于1∶6400,2/3家兔血清之凝集价达上述要求即为合格。 1.3菌种保存 菌种应冻干保存,冻干菌种保存于2~8℃。 菌种冻干后应抽取样品按1.2.2项进行检查,合格后可使用3年。以后每次生产前必须检查全部特性一次,合格者可继续使用2年。 [b]2 菌苗制造[/b] 制造伤寒、副伤寒甲二联菌苗所用的每一菌种选用2个菌株。 2.1菌种 冻干菌种启开后检查菌形、纯度及进行玻片凝集试验(伤寒菌加用Vi血清),合格后即可使用。每启开1支冻干菌种用于生产不超过6代。 2.2制造用培养基 用pH7.2~7.4的马丁琼脂或其他适宜的培养基。 2.3原液制造 2.3.1接种 采用涂种,接种后置37℃培育18~24小时。 2.3.2采集 采集前应逐瓶检查,有杂菌者废弃。刮取菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水中。 2.3.3纯菌试验 原液采集后应逐瓶取样接种琼脂斜面1管,于37℃培育2天,24~26℃1天,有杂菌生长应废弃。 2.3.4杀菌 原液用甲醛溶液杀菌,各种原液加入甲醛溶液浓度如下: 伤寒菌原液不超过1.1%±0.1%(ml /ml)。 副伤寒甲菌原液不超过1.4%±0.1%(ml /ml)。 加杀菌剂后的原液应放在37℃,不得超过7天,以后保存于2~8℃。 2.3.5无菌试验 纯菌试验合格的原液,应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基及普通琼脂斜面各1管,放37℃培育5天,有本菌生长,可加倍量复试一次;有杂菌生长应废弃。 2.3.6原液合并 无菌试验合格之原液,安不同菌株或不同制造日期分别过滤合并,合并后应加不超过0.5%(g/ml)的苯酚或其他适宜之防腐剂,保存于2~8℃。 2.4原液检定 2.4.1镜检 菌形应正常,无杂菌。 2.4.2凝集试验 原液与相应血清进行凝集试验,其凝集效价不应低于血清原效价之半。 2.4.3无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.4.4浓度测定 应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。 2.4.5免疫力试验 原液于无菌试验合格后与质量检定部门会同进行。抽验批数应不少于生产批数的1/5。方法同1.2.5项,唯所用小白鼠每组至少15只。对伤寒或副伤寒甲毒菌之攻击,均应保护60%小白鼠活存为合格。 2.5原液保存 原液应保存于2~8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀释时不得少于4个月,保存效期自采集之日起为2年半。 2.6菌苗稀释 2.6.1原液配合 稀释前应先将不同菌种所制之原液按比例配合。每一种菌所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下,允许两种菌之间在20%的范围内互有增减;同一种菌不同菌株之原液按等量混合,但每个菌株所加的菌数与应加菌数在总菌数不变的原则下,允许两个菌株之间在40%范围内互有增减。 2.6.2菌苗稀释 稀释菌苗用含0.25%~0.5%(g /ml)苯酚或其他适宜的防腐剂之磷酸盐缓冲生理盐水。 2.6.3菌苗浓度 菌苗每ml含伤寒菌1.5亿,副伤寒甲菌1.5亿。 2.7菌苗分批 同组配合的原液用同批稀释液在同一日稀释的各瓶菌苗为1批。大罐稀释时应按大罐分批,并按分装机分为亚批。 2.8检定 稀释后每批应逐瓶抽样进行无菌试验及测定防腐剂含量(大罐稀释时除外)。 2.9分装 分装后应每亚批抽样送质量检定部门进行成品检定。 [b]3 成品检定[/b] 3.1物理化学检查 菌苗应为乳白色悬液,pH值为6.8~7.4。不应有摇不散的菌块或异物。苯酚含量应为0.25%~0.5%(g /ml)。 3.2菌形及纯度 染色镜检,应为革兰氏阴性杆菌。至少观察10个视野,平均每个视野内不得有10个以上非典型菌(线状、粗大或染色可疑杆菌),并不应有杂菌。 3.3无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 3.4安全试验 3.4.1毒性试验 用体重18~20g之健康小白鼠5只,每只腹腔注射菌苗0.5ml,或用体重350~450g之健康豚鼠2只,腹腔注射菌苗1.5ml,观察7日,应无死亡。 3.4.2防腐剂试验 用体重18~20g之健康小白鼠2只,每只皮下注射菌苗0.5ml,用苯酚作防腐剂的菌苗注射的小白鼠可发生战栗症状,但不应超过半小时,观察7日不得有局部脓肿或死亡。 [b]4 保存与效期[/b] 应保存于2~8℃。自稀释之日起效期为1年半。如原液保存超过1年稀释,应相应缩短效期(自原液采集之日起总效期不得超过2年半)。