人白蛋白(或丙种球蛋白)纯度测定

(醋酸纤维素薄膜电泳法) [b]1试剂[/b] 1.1 巴比妥缓冲液(Ph8.6) 取巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g,加蒸馏水溶解成1000ml。 1.20.5%氨基黑染色液 取氨基黑10B0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及蒸馏水40ml的混合液中。 1.3漂洗液 取乙醇45ml,冰醋酸5ml及蒸馏水50ml,混匀。 1.40.2mol /L氢氧化钠 取8g氢氧化钠,加蒸馏水溶解成1000ml。 1.5透明液 取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。 [b]2 操作[/b] 2.1电泳 将膜条(2×8cm)粗糙面向下,浸入巴比妥缓冲液中,待完全浸透,取出用滤纸吸去多余的缓冲液,将膜条粗糙面向上,加于电泳支架上的滤纸桥上(或桥下),于膜上距负极端2cm处,直线状滴加蛋白质含量约5%的样品2~3μl,通电,电流控制在0.4~0.6mA/cm[总电流量=生产要膜的宽度(cm)×膜条数],同时取新鲜人血清作对照,电泳时间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离达3~4cm为宜。 2.2 染色 电泳完毕,将膜条取下浸于染色液中,2~3分钟后,用漂洗液反复漂洗至底色完全脱净。 2.3 透明 将漂净并完全干后的膜条浸于透明液至全部浸透为止,取出平铺于洁净的玻璃板上,干后即成透明薄膜,可供扫描法测定样品纯度和作为标本长期保存用。 2.4 纯度测定 2.4.1 洗脱法:将漂洗净的膜条用滤纸吸干,与正常人血清的电泳图谱作对照,剪下白(或丙种球蛋白)带A及其他杂蛋白质区带B,分别浸于5ml0.2mol/L氢氧化钠溶液中,振摇数次,至色泽完全浸出后,于620nm波长下测其OD值,以相同条件下,无蛋白质部分的膜条(其长度分别同A及B)作空白对照。 样品中白蛋白(或丙种球蛋白)含量%=A的OD值-A空白的OD值/(A的OD值-A空白的OD值)+(B的OD值-B空白的OD值)×100% 2.4.2 扫描法:将干燥的样品醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动光密度扫描仪,通过反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式测定各蛋白质电泳区带的OD值,根据仪器性能,可自动或手工方法计算出样品白蛋白(或丙种球蛋白)的百分含量。 [b]附注[/b] 用扫描法测定白蛋白(或丙种球蛋白)纯度时,可采用丽春红染色法,其染色液及漂洗液配方如下: 0.2%红染色液: 取丽春红0.2g,磺基水杨酸3g及三氯醋酸3g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml。 漂洗液: 取冰醋酸3ml,用蒸馏水稀释至100ml。