五、探针制备

探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素（如[SB]32[/SB]P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。[SB]32[/SB]P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。[SB]32[/SB]P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用[SB]32[/SB]P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它同位素标记物，同样应注意放射线防护。 非放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素-酶），经杂交反应最终形成：探针-生物素-血凝素-酶复合物（ABC法）。酶催化底物显色，观察结果。与一般的酶反应底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。化学标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。（表18-1） 表18-1　探针标记及特性

标记物	检测方法	特点
[SB]32[/SB]P	β射线，自显影	灵敏度最高，半寿期14天，放射强度1.7MeV
[SB]35[/SB]S	β射线，自显影	灵敏度高，分辨率好，半寿期87天，0.17MeV
[SB]3[/SB]H	β射线，自显影	低敏度高，分辨率高，半寿期12年，0.01MeV
[SB]125[/SB]I	γ射线，自显影	灵敏度高，分辨率高，半寿期60天，0.04MeV
生物素	酶标血凝素，显色	灵敏度好，避免有内源性生物素标本
地高辛	酶标地高辛配体，显色	灵敏度好，分辨率一般
T-T二聚体	酶标抗二聚体抗体，显色	灵敏度好，紫外照射形成二聚体而标记
BrdU	酶标抗BrdU抗体，显色	灵敏度好，细菌内含质粒复制掺入
铕-补骨脂素	荧光	灵敏度一般

缺口平移标记法先由DNase Ⅰ在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。（图18-4、5） 缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（＞1000bp最好），单链DNA、RNA不能用该法标记。随机引物法具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但不能标记环状DNA。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记，因mRNA的多聚（A）尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变检测，该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长，特异性 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue201.jpg[alt]DNA随机引物标记法[/alt][/img] 图18-5　DNA随机引物标记法 好，标记量大，杂交检出信号强。合成探针长度短，一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40％-60％，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构，影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外，还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点，复制合成DNA探针，利用转录载体（DNA），转录合成RNA探针。下面就GIBCoBRL公司（Bethesda Research Laboratories美国）的缺口平移法标记生物素试剂盒（bionick labeling system）为例介绍如下：

试剂：	10x dNTP Mix.250μl	10x Enzyme Mix 250μl
	0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP	0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ
	0.1mmol/L dATP	0.0075 units/μl DNase Ⅰ
	0.1mmol/L biotin-14-dATP	50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
	500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)	5mmol/L magnesium acetate
	50mmol/L MgCl[XB]2[/XB]	1mmol/L β-mercaptoethanol
	100mmol/L β-mercaptoethanol	0.1mmol/L phenylmethyl-
		sulfonyl fluoride
	100μg/ml nuclease-free BSA	50％（v/v）glycerol
		100μg/ml nuclease-free BSA
	Control DNA：5μg pBR322 in TE
	stop buffer 300 mM EDTA
	autoclaved H[XB]2[/XB]O

操作步骤： 将5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相当1μg需标记的DNA量）；－μl灭菌蒸馏水加至45μl；再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀，备用。