二、连续监测法与反应进程的分析

从这个权威性的方法分类来看，前面所提到的二类测酶活性浓度方法都应归纳为动态法。目前广为流行的“动态法”命名显然是不确切的或者是不合适的。应该更多采用IFCC文件中建议的“连续监测法”命名。 从酶反应曲线来比较此二类方法。图17-7是一个典型酶反应过程。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue177.jpg[alt]酶促反应中基质[S]、产物[P][/alt][/img] 图17-7　酶促反应中基质[S]、产物[P] 和反应速率V在不同时间变化的模式图 在酶作用下，底物[S]浓度不断下降，随之有相应产物[P]产生。不少酶在反应一开始的阶段，由于各种因素影响，反应速度较慢，称为延滞期，随后在过量浓度的底物存在条件下，酶反应以恒定的速度进行，不受底物浓度变化的影响，这段反应称为线性反应期或零级反应期。随时间延长，反应速度除与酶量有关，还与底物浓度有关。即v＝k(a－x)，式中a为原来底物浓度，x为消耗的底物浓度，如反应物浓度项上指数为1，称为一级反应，假如反应速率受二种或二种以上物质浓度的影响，则各个反应物浓度项上指数总和作为反应级数，可以分别为一级、二级或多级反应，总的将这段反应时期称为非线性反应期。 很明显如测反应速度的目的是为了从此推算出酶含量的多少，则只有测线性反应期的反应速度才能作到此点。在延滞期、非线性期测的结果不准确，一般是偏低的。 取样法由于方法学上的限制，一般只测二管：一为没发生酶反应的对照管，另一管测酶作用一段时间后反应物的变化，实际上测得是平均速度，而且二管间隔时间都较长，在半小时左右，图17-8中t[XB]0[/XB]，t分别代表不同时间二管反应物的量，虽然从t到t[XB]0[/XB]反应物变化量是相同的。但实际反应过程是多种多样的。 只有当反应如曲线A时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中是很少见的，图中曲线B代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线C说明在测定期间包括了延滞期，曲线D则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。 假如从上节叙述中得出一个重要结论：即在设计和选择测定酶活性浓度方法时必须是在“最适条件”下测定最大反应速度。那么从这段叙述中可得出一个对上述结论一个很重要的补充，即所测的最大反应速度还应该是初速度即V[XB]0[/XB]。 理论上的V[XB]0[/XB]在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在5％内所测到的反应速度都可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在20％以内的反应往往还在线性反应期。 连续监测法能满足上述重要要求。由于不需停止酶反应。很容易得到整个酶反应曲线，然后根据反应曲线情况，避开延滞期和非线性反应期，只在线性反应期测定最大反应初速度。同时由于分光光度法的高灵敏度，自动生化分析仪的高精密度，连续监测法能在很短时间，甚至在1分钟反应时间，准确测定反应速度，从而求出准确的酶活性浓度。“固定时间法”测定时间长达30分钟，很难满足上述方法学上测定初速度V[XB]0[/XB]的要求。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue178.jpg[alt]二点测定法中可能引起的误差[/alt][/img] 图17-8　二点测定法中可能引起的误差 从理论上说，只有当测定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能测出真正的Km。用“固定时间法”测出的速度受到逆反应速度的影响。可以下式表示有逆向反应存在时的酶反应过程。 k1　k[XB]2[/XB]　k[XB]3[/XB] E＋S→ES→EP→E＋P ←　←　← K[XB]－1[/XB]　k[XB]－2[/XB]　k[XB]－3[/XB] 存在着EP和P时，就会出现逆反应，此时所测的为一表观速度（Va）或反应的净速度。 Va＝k[XB]2[/XB][ES]－k[XB]－2[/XB][EP] [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue179.jpg[alt][/alt][/img] [E]t代表酶总量，在反应过程中包含了游离酶[E]、酶底物复合物[ES]和酶产物复合物[]EP]。 Ks为[ES]的解离常数，Kp为[EP]的解离常数，故： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue180.jpg[alt][/alt][/img] 代入上式得： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue181.jpg[alt][/alt][/img] [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue182.jpg[alt][/alt][/img] 根据Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue183.jpg[alt][/alt][/img] 在反应特定时间，产物[P]为一定值，上式得： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/linchuangshengwuhuaxue/linchuangshengwuhuaxue184.jpg[alt][/alt][/img] 此公式从理论上说明，如所测反应有逆反应存在时，不存在原来的米-门方程式。用各种作图法很难求出准确的米氏常数。如果说所测酶反应不仅存在着逆反应，产物还抑制了酶反应，则动力学公式将更为复杂。这就是为什么不仅在建立方法时，就是在研究酶的动力学时，也总是希望所测量的都是酶反应的初速度。 以上这二类方法并不是概括了所有测酶活性浓度的方法，也并不排除在非线性反应期测酶活性浓度的可能性。如固定底物变化量，则不同标本达到此变化终点的时间，与酶量成反比例，Somogyi曾提出一种测淀粉酶的方法，酶与底物混合后。每隔半分钟取一滴出来加入碘液呈色，观察颜色由紫色变为红色时间，也就是淀粉酶全部水介变为糊精的时间，并由此时间的长短计算出酶含量高低，这类方法不需使用很高浓度的底物，有其独特之外，在自动生化分析仪中也曾使用类似的方法，值得人们重视。