四、测定方法、标本处理等对测定结果的影响

除了生理条件可引起酶测定值的变化外，还有其它一些非病理因素也会引起实验室测定结果的变化。 [b]（一）酶测定方法[/b] 酶测定方法大致经过三个历史发展阶段，50年代以前大都使用“固定时间法”，即让酶与底物作用一段固定时间，一般为半小时左右，然后停止酶反应，用光电比色测产物生成量或底物消耗量，从而计算出酶催化反应的平均速度。再据此按各作者自己定义的“单位”向临床报告测定结果。这些所报的单位往往在前面冠以作者的姓名命名，例如ALP根据不同测定方法就有金氏单位、鲍氏单位、国际单位等等。同一标本不同单位结果从表面数值看可以差异很大。如ALP上列三种单位参考值分别为3-13金氏单位，0-3鲍氏单位，20-80国际单位。 50年代中期，国际临床实验室开始采用“连续监测法”，就是习惯上所称的“动态法”。需要使用生化分析仪，可以测酶反应的初速度，其结果远比“固定时间法”所测平均速度准确，在高浓度标本时尤为明显。这样同一疾病患者用两种方法所测酶的结果并不一定平行一致。在疾病急性期，用新法测定结果增加倍数常明显超过老法。例如在肝炎用赖氏法测ALT很少超过参考值上限的十倍。改用新法，在肝炎急性期可得到超过参考值上限数十倍乃至百倍以上的结果，由于后者结果和临床病理变化相一致，结果准确。目前在发达国家中，新法已几乎取代了老法，我国也已开始广泛应用新法。本书各论在讨论各种疾病酶变化时，将主要根据新法加以叙述。用新法也就是“连续监测法”所得结果，目前已基本统一使用1964年国际生化协会所规定的国际单位（IU）：即以每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。如表示血清中酶浓度多以U/L表示之，即IL标本（血清）中含的酶量，我国医学界对此表示方法已经熟悉习惯。我国现在规定SI制为计量的法定单位，SI制的酶单位为Katal，即每秒能催化1总分子底物的酶量为1个Katal，此单位不仅我国医学家不熟悉，国际上应用不多，如有可能可同时用两种单位报告结果，或者注明转换系数，即1U＝16.67μKatal。 但即使同使用连续监测法，同用IU/L报告结果，不同实验室测定结果仍可出现较大差异。这是因为上述二法是通过测酶催化速度来间接表示酶量高低，而酶催化的速度还受很多其它因素影响。首先是温度，在国际单位定义中并未规定测定温度，而反应速度随温度升高而加速，一般说每增加10℃，反应速度将增加一倍。因此同一标本、同一方法，在37℃所得结果将显著高于30℃。虽然国际临床化学协会（IFCC）推荐30℃为酶测定温度，但临床实验室由于实验工作方便等因素，愈来愈多使用37℃。因此本书各酶测定参考值将以37℃所测结果为准，某些数据如在30℃测定将在结果后面用（30℃）表示。 除温度外，测定时条件的不同也可能引起结果明显差异。最突出例子是ALP测定，用二乙醇胺为缓冲液测出ALP结果比用氨基甲基丙烷为缓冲液的高2-3倍。又如在ALT测定时，如在底物中加入磷酸吡哆醛比不加者结果可增高20％-100％。正因为如此，为防止临床医生产生错觉，认为IU/L结果在国际上应一致。目前实验室常以U/L，而不以IU/L向临床报告。 总之，临床医师在分析酶测定结果（U/L）时应以给报告实验室的参考值为准，盲目套用文献结果或与其它实验室结果相比较，有可能得到不恰当的结论。 前面已提到从70年代以来，随免疫技术发展，出现利用酶的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的质量。测定结果不是以U/L报告而是直接用ng/ml，μg/L等报告酶蛋白含量高低。如临床医师看到这样的报告，就可知道此时使用了最新的免疫学方法测酶，其临床意义有可能与前两种方法结果有差异。例如国外公认，同样测CK-MB，用免疫学方法所测结果诊断价值最高，此问题将在后专门叙述。 [b]（二）标本的采集、处理与贮存[/b] 在实验室测定酶之前，标本还要经过采集、分离血清和贮存等一系列处理过程。而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。 采取血液标本时最容易引起实验室误差的是抽血不当，或者实验室急于分离血清，因此体外溶血。由于大部分酶在细胞内外浓度差异明显，少量血细胞的破坏就有可能引起血清中酶明显升高。最明显例子是LD，红细胞中LD约为血清的100倍，这样，只要有轻度溶血，如1/100红细胞破坏，就足以使血清中LD升高一倍，常使原为正常的血清LD值超过参考值上限。其它如CK，虽然红细胞中无CK，但含有丰富腺苷酸激酶（AK），进入血清能使某些用“连续监测法”测定CK的值假性升高，红细胞中酶的干扰，不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后1-2小时实验室必须及时离心，分离血清。 除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，例如EDTA为金属离子螯合剂，在去除Ca[SB]2+[/SB]同时也去除其中Mg[SB]2+[/SB]、Mn[SB]2+[/SB]等离子，Mg[SB]2+[/SB]是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）作用的激活剂，其它如草酸盐、枸橼酸盐乃至肝素都对一些酶有一定程度抑制。有必要时，可考虑使用肝素为抗凝剂，在常用抗凝剂中它对酶影响最小的。 酶蛋白不稳定，易失活，ACP是最明显的一个例子。此酶在中性或碱性环境中极不稳定，血液在37℃放置1小时，ACP活性可下降50％。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存，表（7-3）是常用酶在不同温度情况下的稳定性。 从表7-3可看出－25℃将血清冻结并没有太大优点，相反有些酶如ALD、ALT在融冻时被破坏。有文献报道用液氧在－195℃贮存血清，常用酶如ALT、AST、ALP、CK、LD、GGT和AMY，在10个月活性变化不大。个别酶如LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。 表7-3　酶在不同温度储存的稳定性（活性变化小于10％）

酶	室温（25℃）	冰箱（0-4℃）	冰冻（－25℃）
ALD	2天	2天	不稳定[SB]※[/SB]
ALT	2天	5天	不稳定[SB]※[/SB]
AST	3天	1周	1月
ALP	2-3天	2-3天	1月
GGT	2天	1周	1月
CHE	1周	1周	1周
LAP	1周	1周	1周
CK	1周	1周	1周
LD	1周	1-3天	1-3天
ICD	1天	2天	1天
AMY	1月	7月	2月
LPS	1周	3周	3周
ACP	4小时[SB]￥[/SB]	3天[SB]§[/SB]	3天[SB]§[/SB]
亚铁氧化酶I	1天	2周	2周
（铜氧化酶）

※酶不耐融化； ￥　标本未酸化； §标本加枸橼酸到pH5