七、载脂蛋白测定

血清载脂蛋白（Apo）包括ApoAⅠ、AⅡ、B[XB]100[/XB]、CⅡ、CⅢ、E和（a），已属常规检测项目。血清中载脂蛋白均结合于脂蛋白中，测定时要加用解链剂，使脂蛋白中Apo暴露再进行测定。 目前测定血清中Apo的含量的方法是利用相应特异抗体试剂进行测定。现有羊抗人ApoAⅠ、AⅡ、B[XB]100[/XB]、CⅡ、CⅢ、E和(a)等抗体试剂。测定原理是将某一特异抗体加到待测人血清中，即与血清中相应抗原形成抗原抗体复合物，根据复合物的量，即可测出血清中某一Apo含量。例如在人血清中加入抗人ApoAⅠ抗体，即与血清中ApoAⅠ（抗原）结合形成复合物，再定量即可测出血清中ApoAⅠ含量。 ⒈免疫扩散法先制备含Apo抗体的琼脂糖凝胶，间隔等距离打孔，加入待测人血清，水平置于温箱（37℃）保温24或48h，抗原从孔中间向周围扩散，因凝胶板中有相应抗体，经一定时间扩散后，最后在凝胶孔周围形成一圆型沉淀圈，测量其圆直径，以圆的面积大小计算血清中Apo含量。该法要求在测量圆周大小时，一定要精确到0.1mm。这一测定方法可适用于以抗体为试剂贩所有微量蛋白的测定，但易受多种因素的影响，难以测准，有淘汰的趋势。 ⒉免疫火箭电泳先制备含某一Apo抗体的琼脂糖凝胶，靠近阴极端打孔，加入待测血清，进行电泳。血清中Apo抗原往正极移动，一定时间（约3h）后，即可形成类似火箭的沉淀峰，根据火箭峰高度或面积的大小计算血清中Apo含量。在严格掌握电泳条件下，本法是一种较为简便、试剂用量少的好方法。 ⒊免疫比浊法免疫比浊法分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。 Apo的特异抗体与血清中相应的抗原结合形成抗原抗体免疫复合物，并形成微细颗粒，混悬于溶液介质中，光线通过这种浑浊介质溶液时被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比。在抗体量一定的条件下，抗原越多，抗原抗体复合物越多，溶液越浑浊，吸收光越多，以此对抗原进行定量，这种通过测定光吸收量的方法称为透射比浊法。该法是目前使用最为广泛的方法，快速准确，可在自动生化分析仪上作批量检测。 当光线通过含抗原体复合物的浑浊介质溶液的混悬颗粒时，出现光散射作用，散射光强度与溶液中混悬颗粒的量成正比，这种测定光散射强度的方法称为免疫散射比浊法。该法的进行，需要有具备测定散射光的仪器如散射比浊仪等。 免疫比浊时，由于抗原与抗体结合的过程中，吸收度与浓度之间不呈线性关系，一般是三次方程曲线关系。若要将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过三次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算。免疫比浊的实际操作过程中，可采用终点法或速率法，用五点或七点不同浓度进行定标，经三次曲线方程拟合求出一条能反映真实情况的浓度与吸光度的关系曲线方程，作为定量的工作曲线。如果以单一标准浓度定标，以一次方程直线回归运算，所测结果仅在标准浓度上下波动，真正的过低和过高值无法测准。 免疫比浊法所用抗体应是单价、特异并且高效价的，尤其是抗体若非单一而混有少量其他蛋白抗体，在血清中形成的复合物将是一种大杂烩，非单一蛋白的复合物，测出结果偏高而不准确。