四、含重组质粒的细胞菌落的鉴定

含重组质粒的细胞菌落常用的鉴定方法有：①小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；②α互补；③插入失活；④杂交筛选。下面简要介绍小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析。小规模制备质粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA试剂盒或采用下述方法： 1.挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于2ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 2．将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。 3．吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 4．将细菌沉淀重悬于200μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl（pH8.0） 10mmol/LEDTA（pH8.0） 溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，高压下101bf/m[SB]2[/SB]（6.895×10[SB]4[/SB]pa）蒸气灭菌15min，贮存于4℃。 5．加200μl新配制的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH 1% SDS 盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 6．加200μl溶液Ⅲ 溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml 冰乙酸11.5ml 水28.5ml 盖紧管口，将管倒置，温和振荡10min，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。 7．用微量离心管于4℃以12000g离心5min，将上清转移另一离心管中。 8．加等量酚和氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中。 9．用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。 10．用微量离心机于4℃以12000g离心5min。 11．小心吸去上清液，将离管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 12．用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤1所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀，干燥10min。 13．用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μl/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。 14．用适当限制性内切酶分析所得DNA。