二、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl[XB]2[/XB]或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 用CaCl[XB]2[/XB]制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。 1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。 2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。 3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl[XB]2[/XB]重悬每份沉淀，放于冰上。 6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl[XB]2[/XB]重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。 9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。 10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。 11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。 12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO[XB]4[/XB]和相应抗生素的SOB培养基上。 14．将平板置于室温至液体被吸收。 15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。