第六节　血管细胞培养的鉴定

[b]一、血管内皮细胞鉴定[/b] 在操作过程中，可能混入成纤维细胞平滑肌细胞。鉴定血管内皮细胞基础是根据他自身的形态、性质。内皮细胞有三个显着特点：①形态学呈单层铺路石样排列，如前所述；②电子显微镜下可发现Weibel-Palade小体；③存在第Ⅷ因子关连抗原（VWF），用免疫法测定为阳性反应。此外，在硬化血管取材时，巨噬细胞转化的泡沫细胞可能混入，除形态学的差异外，泡沫细胞含有丰富的氧化修饰的LDL，氧化LDL与相应抗体反应后在荧光显微镜下极易区别。 [b]二、平滑肌细胞的鉴定[/b] 如前所述，平滑肌细胞除形态、排列有其自身特点外，重要一点是胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝及与其相连的致密体。在培养时，对正常组织而言，主要混有成纤维细胞，内皮细胞。能够准确识别其中一、二类细胞，其他细胞也就不难鉴别了。 [b]三、常用的鉴定方法和条件[/b] 细胞鉴定法一般有细胞形态学观察法、免疫化学技术观察法、活细胞直接观察法和培养细胞生物化学性状检测。 1．细胞一般形态学观察法 常用方法有两种，一是用普通显微镜，将细胞固定，染色后观察；二是用电子显微镜将组织细胞切片、固定、包埋后观察。 2．免疫化学技术观察法 免疫细胞化学技术是用荧光素或酶等标记物或显示物标记特异性抗体，通过免疫学中的抗原抗体反应与细胞内的相应抗原结合，形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合物，用荧光显微镜或普通显微镜观察复合物存在与否，达到鉴别细胞的目的。这一技术包括标本处理（制备、保存、固定等），染色和结果判断。 3．活细胞直接观察法 细胞培养法可直接观察活细胞，是组织培养技术的一个突出优点。培养的活细胞在一般显微镜下，由于细胞透明，反差很少，不易看清细胞内的结构，因此这一技术需要采用相差显微镜。较新的显微摄影术（time-lapse cinemicrophotagraphy,TLCM）是直接记录活细胞动态变化最为理想的方法，能记录细胞连续动态变化过程，具有客观性和示教性。 4．培养细胞生物学性状检测 观察细胞在体外培养过程中，从初代培养开始，到继续培养和传代培养必须每天进行常规观察细胞是否有污染，生长状况，培养液是否需要更换，这是保证实验成功的基础。所谓生物性状检测包括上述三种方法的运用，这里主要谈以下几个方面：①形态学观察，培养的细胞可能每日每时都会发生形态改变，形态观察又包括一般形态学观察，超微结构观察如亚细胞器微绒毛的形态，微丝微管，核仁的形态和数量排列分布状况等；②细胞增殖生长观察，包括细胞计数，计数细胞是测定细胞绝对增长数量常用最简便的方法；细胞分裂指数（mitotic index,MD）即细胞分裂指数=细胞分数相数/1000细胞×100。计算分裂相时要注意掌握确定分裂相标准，其中主要是确定好划分间期和前期、末期和间期等的界限。另外，还有两个指标即接种存活率和克隆形成率，细胞接种存活率=形成克隆数/接种细胞数×100，细胞数接种率=贴壁存活细胞数/接种细胞数×100；③其他观察，如癌细胞具有浸润性生长能力，这一能力是检测癌细胞的指标。 总之，动脉粥样硬化是多因素、多细胞相互作用的结果，细胞培养是研究这一疾病最有效方法之一。不同的动物血管组成、性质不同；不同研究者有不同的实验目的，所采用的方法也不尽相同。这里只是将血管内皮细胞和血管中膜平滑肌细胞的培养和鉴定作一扼要叙述，随着研究的深入，方法和手段也会不断改进和发展。 （黄俊军　周新）