一、胶原的提取

动脉血管壁胶原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他杂质，由于胶原为杆状三螺旋结构，能耐受胃蛋白酶的作用，但是两端球蛋白结构能被胃蛋白酶水解。胶原纤维内分子间的共价交联是由分子末端赖氨酸或羟赖氨酸形成，用胃蛋白酶切断末端交联结构，使胶原分子的巨形结构被破坏，从完整分子可提出各种类型的胶原。 （一）胶原的初步分离 1．小心取出动脉血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗净凝血块，3kr/min离心10min。 2．冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸馏水洗涤3次。 3．将组织破碎，加三倍体积组织匀浆处理液（0.5mol/L乙酸，pH2.5，1%胃蛋白酶）于4℃48h,16kr/min离心45min，同样方法重复3次。 4．向留取的上清液中缓缓加入NaCl，最终达到4mol/L浓度，搅拌12～24h，15kr/min离心45min，弃上清。 5．进一步分离各种胶原可用分段盐析和柱层析法进行操作。 （二）胶原的分段盐析 1．取初级提取物加0.1mmol/L乙酸，加NaCl至0.7mmol/L，15kr/min离心20min。沉淀提取Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，上清提取Ⅳ、Ⅴ型胶原。 2．沉淀，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保湿16h，10kr/min离心20min，上清液加NaCl至4mol/L，离心，沉淀物为Ⅳ型胶原。 3．1mol/L NaCl溶解沉淀，加3倍体积Tris-HCl pH7.4，10kr/min离心20min，沉淀为Ⅲ型胶原。 4．上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min离心20min，沉淀为Ⅰ胶原。 5．取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min离心20min。 6．沉淀溶于4倍体积1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4，加NaCl至4mol/L 10kr/min离心20min。 7．上清加NaCl至4mol/L，调pH到3.5,离心得沉淀再加5倍体积0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液悬浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L，10kr/min离心10min，沉淀为Ⅳ型胶原。 8．将6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE悬浮16h，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min离心10min，沉淀为Ⅴ型胶原。 （三）将初步提取的胶原加到DEAE纤维柱上，用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脱，230nm波长检测洗脱物。因为胶原在pH7.5时均带正电荷，不与DEAE柱结合，所以被柱结合的则为非胶原蛋白。