三、免疫印迹法检测ApoE表型

由于IEF法需大型设备，工作量较大，极大地限制了该法的临床应用。免疫印迹法为目前检测ApoE表型最常用方法。此法直接用血清（或血浆）作为样品，脱脂后进行IEF电泳，然后用特异性多克隆或单克隆抗体进行免疫印迹反应，根据黑色后图谱即可确定ApoE表型。此法比IEF法更省时、简便、准确。 1．仪器与试剂 电泳仪，垂直板式电泳槽，转移电泳槽，NC膜；主要试剂有：⑴3：1（V/V）乙醚脱脂液；⑵样品溶解液；0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素；⑶两性电解质（Ampholine,pH4～6,LKB产品）；⑷丙烯酰胺（Acr）、N-N'甲叉双丙烯酰胺（Bis），Serva产品；⑸TEMED（Sigma产品）；⑹电泳缓冲液：1mol/lNaOH,1mol/L H[XB]3[/XB]PO[XB]4[/XB]；⑺转移电泳缓冲液：含20%甲醇，39mmol/L甘氨酸，48mmol/lTris和0.0375%SDS；⑻洗涤液（TPBS）含0.05%吐温-20，0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4；⑼封闭液：含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS；⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清；⑾HRP标记的兔抗羊IgG：⑿4-氯-1-萘酚（Sigma产品）。 2．实验方法 （1）样品处理：抽取空腹血1～2ml，分离血清。取血清10μ置于预冷乙醇/乙醚（3：1）脱脂液中-20℃脱10h以上，离心（2500r/min）15min，弃上清后的加等量预冷的无水乙醚继续脱脂0.5h，再次离心，将沉淀样品用氮气吹干或抽真空使残余乙醚挥发；（2）IEF电泳：电泳前将样本溶解在100μl溶解液中（0.01mol/l Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素），放置37℃，1h。PAG凝胶浓度为5%，内含尿素（8mol/L），2%Ampholine,0.025%过硫酸胺（AP）及0.033%TEMED。电极液：阴极为1mol/LN[XB]a[/XB]OH，阳极为1mol/LH[XB]3[/XB]PO[XB]4[/XB]。每份样品加样20μl，IEF条件初为300V，0.5h,然后调至700V，电泳5h。或1000V预冰30min（10℃）后，关电源，在靠阴极处放上IEF加样箔，每一空内加样后，继续电泳2h30min；（3）免疫印迹：转移电泳条件18V/cm，按转移电泳槽要求将凝胶上的蛋白电泳转移到NC膜上。5h后取出NC膜，放入封闭液内，室温过夜。用TPBS洗3次，然后用羊抗人ApoE抗血清（1：2000TPBS稀释）室温孵育6h。倾去液体，充分洗涤后，加入HRP标记的兔抗羊IgG（1：200）室温孵育2h。用PBS洗膜3次，每次10min。称取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇（-20℃）中，放入20mlPBS，加入10μ130%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]，放入已洗净的NC膜，缓缓摇动至蛋白带显出，蒸馏水洗后，晾干，暗处保存；（4）ApoE表型判定：根据所显示ApoE区带图谱即可确定ApoE表型，见图19-4所示。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua153.jpg[alt]6种ApoE表型免疫印迹图（模式）[/alt][/img] 图19-4 6种ApoE表型免疫印迹图（模式） 此方法样品用量少（10～20μl血清即可），故特别适合临床检验与大规模人群调查。由于ApoE糖类含量会影响IEF结果，所以在IEF前常用唾液酸酶预处理标本，以除去唾液酸残基。唾液酸酶的处理加强了主要区带，减弱了干扰的唾液酸型区带，克服了未用酶处理时，E3/2和E3/3有时难以分辨的困难，提高了表型判别的准确性。另外，如选用pH4～8范围的梯度作IEF电泳，则几乎能检测出至今为止所发现的所有异构体表型。国内吕新跃等应用自制E[XB]6[/XB]C[XB]3[/XB]株ApoE单克隆抗体作为一抗，用兔抗鼠IgG-辣根过氧化物酶标二抗，建立微量脱脂血清IEF及免疫印迹检测ApoE表型，亦取得较好效果。