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二、血清ApoAⅠ（B100）透射比浊测定法

脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）的定量测定。 [b]（一）手工操作[/b] 1．原理 血清ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）+抗人ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）→抗原抗体复合物→测定光密度 2．试剂（伊利康） （1）Apo缓冲液（RⅠ），含4%PEG6000和表面活性剂 （2）羊抗人ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。 （3）ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）参考血清（RⅢ） 3．操作 （1）按ApoAⅠ抗血清液或ApoB[XB]100[/XB]抗血清100μl，加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂（Apo抗体液）。最好临用前配制当天用量。 （2）各试剂用量如下表
ApoAⅠApoB[XB]100[/XB]
标准管测定管空白管标准管测定管空白管
参考血清5μl　　5μl　　
待测血清　5μl　　5μl　
ApoAⅠ抗体液1.0ml1.0ml1.0ml　　　
ApoB[XB]100[/XB]抗体液　　　1.0ml1.0ml1.0ml
混匀各管，37℃保温10min，波长340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。 （3）定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点（3～9点），按y=a+bx+cx[SB]2[/SB]+dx[SB]3[/SB]的3次方程回归曲线进行定标，制作参考工作曲线。 ①校正工作曲线的绘制： 配制抗血清稀释工作液：按RⅠ试剂0.9ml，加RⅡ试剂100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。 制备5点校正液：取RⅢ（参考血清），用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度，第5管为原参考血清浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。 表18-20 标准曲线制备的各管（点）浓度
管号12345
1号管（0）（μl）5　　　　
2号管（1/8）（μl）　5　　　
3号管（1/4）（μl）　　5　　
4号管（1/2）（μl）　　　5　
5号管（1/1）（μl）　　　　5
Apo抗体液（ml）1.01.01.01.01.0
混匀各管，置37℃水浴保温10min，按程序上机作工作曲线。 ②标本测定：吸待测血清（测定管）5μl，加上述稀释抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保温10min，上机读数，打印结果。 ③如测定值超过工作曲线上限值，仪器会打印显示“过高”，此时，将待测标本稀释1倍再测。 ④每批号的抗血清应作一次多点定标，即测定标本的抗血清应与定标的抗血清是同一批号抗血清。 [b]（二）生化分析仪测定[/b] 1．原理 脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）的定量测定。 ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）+抗人ApoAⅠ（B[XB]100[/XB]）→抗原抗体复合物→测定吸光光密度 2．双试剂单（双）波长法 （1）试剂（温州伊利康） RⅠ：Apo缓冲液，含4% PEG6000和表面活性。 RⅡ：羊抗人ApoA（B[XB]100[/XB]）稀释抗血清 RⅢ：Apo定值血清 （2）各试剂及标本用量如下表：
项目血清Apo缓冲液 （RⅠ）ApoAⅠ抗血清液 （RⅡ）ApoB[XB]100[/XB]抗血清液 （RⅡ）
ApoAⅠ2～5μl300～350μl80～100μl　
ApoB[XB]100[/XB]2～5μl300～350μl　80-100μl
（3）定标：以5点Apo梯度浓度，采用免疫定标法按表18-21参数上机定标，如图18-5所示。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua146.jpg[alt]ApoAⅠ 五点免疫定标曲线图[/alt][/img] 图18-5 ApoAⅠ 五点免疫定标曲线图（以CL-7200仪器为例） （4）上机（终点法或两点法） [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua147.jpg[alt][/alt][/img] （5）说明：①Apo测定的光密度从340～700nm范围都可采用，多用340nm；②国内已有的Apo试剂盒均无需处理；③血清标本也无需处理，均可直接检测；④本法适用于多种类型的全自动生化分析仪检测，自动扣除空白，快速准确；⑤效价不同的抗血清，其用量应作适当的调整。 (5)计算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定标自动运算。 3.单一试剂单波长法 (1)试剂同双试剂法 (2)标本及试剂用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相应的Apo缓冲液(RⅠ)0.3ml的比例混合成单一试剂(Apo抗体液)。最好临用前配制当天用量,此抗体液置2～8℃保存一周有效。 （3）定标：按五点梯度稀释定值血清（见表18-21），以终点法或两点法进行免疫定标。 （4）按以下步骤操作： [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua148.jpg[alt][/alt][/img] （5）以△A=A2-A1值按免疫定标自动运算。 （6）说明：①该法一般用半自动生化分析仪；②通过设延迟时间以扣除空白；③RⅠ、RⅡ试剂以临用时混合为好，未用完的混合试剂应置于2～8℃冰箱保存，只允许使用一周；④血清标本无需再处理。 4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自动生化分析仪检测的有关数据。 （1）上机参数（以CL-7200型为例）如表18-21所示。 表18-21 自动生化分析仪检测Apo有关参数
　ApoAⅠAⅡBCⅡCⅢE
反应类型终 点法
样品量3μl3μl3μl8μl3μl5μl
测量波长600nm（第一）数据数据700nm700nm700nm
700nm（第二）数据数据340nm340nm340nm　
反应时间第一波长5min数据数据数据数据数据
第二波长4.99min数据数据数据数据数据　
试剂Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl
试剂Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl
单位g/Lg/Lg/Lmg/dlmg/dlmg/dl
标准浓度点数555555
（2）标准曲线制备参数如表18-22所示。 表18-22 生化分析仪检测Apo的定标浓度
标准管号123456
稀释倍数01：21：41：81：160
ApoAⅠ度数(g/L)172864321.510.80
ApoAⅡ度数(g/L)361894.52.250
ApoB浓度(g/L)1809145.522.611.30
ApoCⅡ浓度(mg/dl)4210.50.250
ApoCⅢ浓度(mg/dl)52.51.250.630.310
ApoE浓度(mg/dl)1052.51.250.6250
5．单一试剂和双试剂检测方法的比较 单一试剂和双试剂在全自动生化分析仪测定的光密度变化过程，如图18-6所示。 从理论上考虑任何一种生化测定方法的试剂，临用时混合最好，可以消除试剂各种成份的自身化学变化和相互影响。而在实际工作中，是不可能的，只能是将几种不会起化学反应而又无相互影响的试剂配制成2～4种，临用时按一定比例配制使用。临床化学试剂盒，目前主要以1或2种试剂形式供医学检验使用，即单一试剂和双试剂两种形式。 笔者认为双试剂比单一试剂好，尤其是含酶试剂和免疫试剂以双试剂包装形式为好，有利于对酶的活性或抗体效价的保存。单一试剂是所有试剂混合在一起，存放过程中，有可能因化学物质的存在而损害试剂中的工具酶或抗体，存放时间越长，损害可能性越大，然而双试剂不存在这一问题。 对脂质的测定双试剂法更显其优越性，因为血清中脂质与载脂蛋白是以脂蛋白的形式存在，当测定试剂与血清标本混合后，首先解联脂蛋白，让其释放出脂质和载脂蛋白，。作为免疫测定试剂还兼有使载脂蛋白抗原决定簇暴露的作用。当R1试剂作用完后，加进第二试剂（R2）后，使其抗体适应抗原决定簇的要求，达到抗原抗体结构呈完全的互补状态，从而产生最大的抗原抗体结合量，达到定量的目的。双试剂测定法，既能自动扣去空白，又能使化学反应快速进行，从而迅速地完成检测的全过程。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/dongmaizhouyangyinghua/dongmaizhouyangyinghua149.jpg[alt]单双试剂法反应过程的光密度变化曲线图[/alt][/img] 图18-6 单双试剂法反应过程的光密度变化曲线图 A：双试管法；B：为单一试剂法 （贺小玲　胡汉宁）