第一节　载脂蛋白基因表达的抑扬

[b]一、ApoAⅠ[/b] ApoAⅠ是HDL的主要蛋白，占HDL总蛋白的70%。1989年由美国Breslow实验室首先将编码人类ApoAⅠ的基因分别整合到小鼠及大鼠的基因组内。ApoAⅠ在小鼠和大鼠体内的增强表达选择性地升高了血浆HDL胆固醇（HDL-C）水平。这项观察与人群研究结果一致，表明血浆ApoAⅠ浓度与HDL-C水平正相关，同时也提示可以采用升高血浆ApoAⅠ水平的措施来达到升高血浆HDL含量，从而改善血浆脂蛋白图谱特征（lipoprotein propile）的目的。 人类ApoAⅠ基因在小鼠体内的增强表达同时也改变了小鼠HDL的物理特性。野生型小鼠（Wildtype）的HDL颗粒通常显示均一性大小的特点。当表达了人类ApoAⅠ基因后，小鼠HDL颗粒分成大小二类，分别对应于人类血浆中的HDL[XB]2[/XB]和HDL[XB]3[/XB]颗粒尺寸。这说明ApoAⅠ本身能控制HDL的颗粒大小和分布，同时也解释了人类HDL颗粒大小的多态型。这种高效表达有人类ApoAⅠ基因的动物还被用来研究饮食和药物对HDL-C和ApoAⅠ水平的影响。实验结果显示许多食物和药物成分在大幅度改变血浆HDL-C和ApoAⅠ浓度时，不影响ApoAⅠmRNA水平。因而提示如下两点：（1）血浆ApoAⅠ的调控环节主要存在于转录后水平（posttranscriptional level），而不是转录水平；（2）在很大的生理甚至病理范围内，ApoAⅠ或HDL受体被饱和的可能性很小。在动脉粥样硬化的发病研究方面，ApoAⅠ基因的增强表达能减少动脉内泡沫细胞的形成和堆积。HDL能预防和对抗动脉粥样硬化发病的理论学说由此得到支持。 与ApoAⅠ基因的增强表达相对应，剔除（knockout）内源性ApoAⅠ基因的小鼠也研制成功。正如所料，这种小鼠由于没有表达ApoAⅠ基因，血浆HDLCh浓度极低。用普通饲料喂养这种缺乏ApoAⅠ基因的小鼠后，血浆总胆固醇和HDL-C均下降约75%左右。HDL所含胆固醇酯的流动性下降八倍，但组织内所含的游离和酯化的胆固醇含量正常，唯有肾上腺组织的胆固醇酯含量下降。有趣的是，组织学检查表明这种缺乏ApoAⅠ的小鼠，即使用高脂饲料喂养20周后，也不出现动脉粥样硬化的病理学变化，因而提示：虽然高浓度血浆ApoAⅠ和HDL能预防和对抗动脉粥样硬化的形成，低浓度血浆ApoAⅠ和低浓度HDL-C本身却不足以诱发动脉粥样硬化。 [b]二、ApoAⅡ[/b] ApoAⅡ在HDL中的含量仅次于ApoAⅠ，约占HDL总蛋白的20%。将人类ApoAⅡ基因在小鼠体内增强表达后，这种ApoAⅡ转基因小鼠的血浆HDL-C水平不受影响。这又与临床观察相一致，即血浆ApoAⅡ浓度与HDL-C含量无显著相关性。然而，这种小鼠的一部分HDL颗粒变小，且仅含有ApoAⅡ，不含ApoAⅠ；另一部分大小正常的HDL颗粒则含ApoAⅠ和AⅡ两者。这提示人类ApoAⅡ可能只影响HDL的颗粒大小而不影响HDL的血浆浓度。在动脉粥样硬化的发病方面，如果同时增强表达ApoAⅠ和AⅡ基因，ApoAⅠ本身的“保护防御“作用反被削弱，提示富含有ApoAⅡ的HDL颗粒不具有抗动脉粥样硬化的能力，也说明HDL的“防御动脉粥样硬化”功能只与ApoAⅠ有关。 [b]三、ApoAⅣ[/b] ApoAⅣ既可结合到HDL也能游离于血浆，主要由小肠合成，其功能尚不明确，推测可能与LCAT的激活、胆固醇逆向转运，以及小肠吸收脂质有关。将人类ApoAⅣ基因在小鼠体内增强表达后，血浆脂蛋白特征并无明显变化，餐后VLDL有升高趋势，小肠吸收甘油三酯、胆固醇、维生素A和E均正常，因而看不出ApoAⅣ有任何特定的生理功能。或许生理状态下的ApoAⅣ水平已足以发挥其作用。 [b]四、ApoB[/b] ApoB是乳糜微粒、VLDL、IDL和LDL的运载蛋白，人类肝脏合成的Apob 是一个完整的长度，分子量约520000道尔顿，称为ApoB[XB]100[/XB]，而小肠所合成的ApoB由于细胞内mNRA的“编辑加工”处理，其分泌出的ApoB分子仅为肝脏所分泌ApoB分子长度的48%，故称为ApoB[XB]48[/XB]。将人类ApoB基因整合到小鼠基因组内增强表达后，血浆ApoB水平上升，总胆固醇含量升高，这主要是由于LDL-C水平升高所致，LDL颗粒内所含甘油三酯的比例增大。尽管野生型小鼠血浆LDL水平远比人类血浆低，ApoB转基因小鼠的血浆LDL上升到相当于人类血浆LDL的浓度。 应用基因重组技术Homanics等首先于1993年剔除了小鼠内源性ApoB基因。这种Apob 缺乏的小鼠不仅表现出VLDL、IDL和LDL-C的下降，而且连HDL-C也降低。纯合子型Apob 缺乏的小鼠在胚胎发育期即死亡，杂合子型的死亡率也显著升高，神经管发育不全。能幸存的杂合子型ApoB缺乏小鼠出现雄性生殖机能下降。虽然HDL-C和血浆ApoAⅠ浓度低，肝组织内ApoAⅠmRNA水平并无异常变化，说明低水平ApoB状态能在翻译后水平影响和调节ApoAⅠ的生物合成。 [b]五、ApoC[/b] ApoC包括三个亚类：CⅠ、CⅡ和CⅢ，其中ApoCⅢ转基因小鼠最先被研制成功。ApoCⅢ主要结合于VLDL和HDL颗粒，其基因表达速率与血浆甘油三酯水平成正比。将人类ApoCⅢ基因在小鼠体内增强表达后，其血浆VLDL颗粒增大，富含甘油三酯，成为典型的人类原发性高甘油三酯血症动物膜型。这种动物血浆ApoCⅢ含量升高，ApoE含量相对下降，游离脂肪酸浓度也升高。动力学研究显示。ApoCⅢ转基因动物所发生的高甘油三酯血症主要是由于其VLDL清除障碍引起，而与ApoB的合成速度无关。从这类小鼠血浆分离出的VLDL对LDL对受体的亲和力下降。但对脂蛋白脂肪酶（LPL）的分解无影响。这项研究证明ApoCⅢ基因的增强表达能直接引起高甘油三酯血症，说明了ApoCⅢ在调节人类血浆甘油三酯水平过程中的重要作用。由于约有三分之一的中年人都表现有不同程度的高甘油三酯血症，而因其他基因异常所引起高甘油三酯血症的机率极小，因此，临床观察和控制ApoCⅢ水平应受到重视。 ApoCⅠ的功能目前尚不明确，已知ApoCⅡ是血浆LPL的生理激活因子。增强表达人类ApoCⅠ的转基因小鼠出现轻度高甘油三酯血症。出乎意料之外的是，增强表达人类ApoCⅡ基因后，小鼠也出现了高甘油三酯血症，其表现如同ApoCⅢ转基因小鼠。这种ApoCⅡ转基因小鼠表现有VLDL堆积，VLDL颗粒内ApoCⅡ比例增大，ApoE比例下降，VLDL清除障碍，而其合成无异常。由此看来，ApoCⅡ的功能远比人们所知道的要复杂。更令人费解的是，剔除ApoCⅡ基因而引起ApoCⅡ缺乏的动物也同样表现有高甘油三酯血症。 [b]六、ApoE[/b] ApoE是HDL和VLDL的蛋白成分之一。也是LDL受体和乳糜微粒残粒受体的结合蛋白。因而在血浆脂蛋白的清除过程中发挥重要作用。1992年由于Shimano等首先研制ApoE转基因小鼠，高效表达大鼠来源ApoE基因，导致血浆ApoE浓度高于正常倍4倍以上，其血浆VLDL和LDL-C含量显著下降。同位素示踪研究显示放射性VLDL和LDL颗粒的清除速度明显加快。不仅如此，这种高ApoE浓度的动物能对抗由高脂饲料诱导的高胆固醇血症。这说明高浓度ApoE能减少空腹状态下的致动脉粥样硬化性质的脂蛋白成分，并防止高脂饮食诱发异常脂蛋白血症。 ApoE基因剔除的小鼠模型也于1992年由Piedrahita等研制成功。与ApoB基因剔除后的表现不同，即使是纯合子型的ApoE基因缺乏，动物也能存活，生殖功能正常。当给这种ApoE缺乏的动物喂以普通饲料后。其血浆胆固醇水平可高达10.34-12.93mmol/L，这种胆固醇主要堆积于VLDL和IDL颗粒内。如果用西方型高脂饲料喂养这种ApoE缺乏小鼠，其血浆胆固醇可高达46.5mmol/L，也主要分布于VLDL和IDL部分。这些小鼠的甘油三酯无明显异常，提示存在有富含胆固醇的脂蛋白颗粒，类似于β-VLDL。动力学研究表明这种ApoE缺乏动物存在严重的脂蛋白清除障碍，完全证实了ApoE的受体结合功能。杂合子型的ApoE缺乏小鼠表现轻度降低的血浆ApoE水平，而其他脂蛋白水平正常，餐后脂血症时间轻度延长。由此可见，即使表达50%的ApoE基因也足以维持正常的脂蛋白代谢状态。 ApoE基因剔除的小鼠是动脉粥样硬化研究的良好模型。这种缺乏ApoE的纯合子型小鼠即使用普通饲料喂养，动脉壁亦出现明显的泡沫细胞沉着堆积。当用西方型高脂饲料喂养四周后，动脉粥样硬化斑块增大3倍以上，其病理特征、组织学分布等十分类似于人类动脉粥样硬化病变。其泡沫细胞内的脂质斑块富含有氧化型脂蛋白颗粒，血浆抗自身氧化型脂蛋白的自身抗体含量也明显升高。小鼠本是很不容易诱发动脉粥样硬化的动物种群，ApoE单个基因的变化能导致严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化，这显示ApoE在人类冠心病发病过程中扮演重要角色。 [b]七、Apo（a）[/b] Apo（a）是一种糖蛋白，以二硫键结合于LDL颗粒的ApoB分子上，野生型小鼠不表达Apo（a）基因，血浆也检测不出Apo（a）蛋白。将人类Apo（a）基因转送到小鼠体内增强表达后，小鼠血浆Apo（a）含量可高达9mg/dl，但不结合到小鼠的LDL颗粒上，而是以游离形式存在。此时如果注射人类LDL到小鼠血液系统，则上述所表达的Apo（a）与人源性LDL结合到一起。这说明人类Apo（a）只特异性与人类ApoB分子结合，也许是由于小鼠ApoB分子缺乏所对应的半胱氨酸残基的原因，尽管流行病学研究资料显示含Apo（a）脂蛋白（LP-（a））与冠心病有着不可分割的关系，增强表达了人类Apo（a）的小鼠并不出现动脉粥样硬化病变。由于人源性Apo（a）不结合到小鼠自身的LDL颗粒上，这项结果可提示Apo（a）本身并无致动脉粥样硬化的特性，或许这种特性是在Apo（a）结合到LDL后才获得并表现出来。