第七节　实验室检查

一、醋酸白试验 用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟，病灶部位变白稍隆起，肛门病损可能需要15分钟。本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果，HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同，只有前者才能被醋酸脱色。醋酸白试验检测HPV的敏感性很高，它比常规检测观察组织学变化还好。但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性、假阳性变白迹象显得界限不清和不规则。美国CDC提示，醋酸白试验并不是特异试验，且假阳性较常见。 二、免疫组织学检查 常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP），显示湿疣内的病毒蛋白，以证明疣损害中有病毒抗原。HPV蛋白阳性时，尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应。 三、组织化学检查 取少量病损组织制成涂片，用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原，则抗原抗体结合。在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成红色。此法特异性强且较迅速，对诊断有帮助。 四、病理检查 主要为角化不全，棘层高度肥厚，乳头瘤样增生，表皮突增厚，延长，其增生程度可似假性上皮瘤样。刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂、颇似癌变。但细胞排列规则，且增生上皮和真皮之间界限清楚。其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成。此种空泡细胞较正常大，胞浆着色淡、中央有大而圆，深嗜碱性的核。通常真皮水肿、毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润。Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣，表皮极度向下生长，代替了其下面的组织、易与鳞状细胞相混，故须多次活检。若有缓慢发展之倾向，则为一种低度恶变的过程，即所谓疣状癌。 五、基因诊断 迄今，HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为HPV检测开辟了新途径。 （一）标本的采集及处理 1．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。在作细胞学检查的同时，将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS离心（3000g，10min）洗涤2次，沉积细胞重悬于1mlPBS中，取0.5ml细胞悬液抽提DNA。 2．标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/l Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/l NaAc（pH5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/l Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃温育30min。 （二）PCR扩增 1．引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L），每区含一系列开放读码框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非编码区及E1、E6、E7和L1区均有保守序列。Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1，该引物与HPv 6、11、16、18及33型有互补序列，也可扩增其它型HPV。 Manos等设计的HPVL1通用引物 MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC 表1

HPV型	MY11的第1个硷基位置	MY09的第1个硷基位置	PCR产物长度（bp）
6	6722	7170	448
11	6707	7155	448
16	6584	7035	451
18	6558	7012	454
33	6539	6987	448

M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T 表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针。公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列，可与　MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列，用于检出的HPV分型。 表2　 Manos等设计的HPVL1PCR产物探针

公用混合探针
GP1　CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC
GP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC
第一个硷基位置
HPV6　6771 HPV11　6757 HPV16　 6631
HPV18 6607 HPV33　6588
型特异探针
探针	HPV型	序列	基因位置
MY12	HPV6	CATCCGTAACTACATCTTCCA	6813—6833
MY13	HPV11	TCTGTGTCTAAATCTGCTACA	6800—6820
MY14	HPV16	CATACACCTCCAGCACCTAA	6926—6945
MY74	HPV18	GGATGCTGCACCGGTCTGA	6905—6922
MY16	HPV33	CACACAAGTAACTAGCTACAG	6628—6648

H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T 2．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/l dNTP贮备液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR缓冲液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。 3．PCR扩增方法和程序：以100μlPCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。 （1）实验前配制预混反应试剂并分装。预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂。每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3。 表3每支反应管中的PCR反应试剂

反应试剂	体积（μl）	终浓度
10×PCR缓冲液	10	1×PCR缓冲液
dNTP贮备液	2	200μmol/L每种dNTP
MY11贮备液	0.5	500μmol/L
MY09贮备液	0.5	500μmol/L
Taq DNA聚合酶	0.5	2.5μ
灭菌蒸馏水	75.5
总计	90.0

（2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂。 （3）加入80-100μl石蜡油，在台式离心机上快速离心数秒钟，使各反应试剂收集于油层下。目前，PCR试剂已商品化，反应体积为25μl。使用时只加入标本DNA即可。 （4）将反应管置PCR扩增仪上，循环参数为95℃30s，55℃ 40s，72℃ 50s循环35次，最后72℃延伸5min。 4．每次试验应设阳性及阴性对照。以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如Caski、HeLa）DNA为阳性对照，以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照。 （三）扩增产物的检测和分析 1．凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。 2．核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。 按照标准方法制32p ATP标记的寡核苷酸探针，需达到约107cpm/pmol特异活性。杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml。在55℃缓慢振荡下杂交2-3h，随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC、0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜，除去多余探针。然后进行洗膜，其条件依所用探针而异：公用混合探针，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探针，56-57℃下10min，并换液重洗1次；MY14及WD74探针，58-59℃下10min，亦换液重洗1次。 用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPv DNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPv DNA。 鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。