第六节　诊断

[b]一、诊断依据：[/b] （一）流行病学及临床表现 （二） 实验室检查 （1）主要是中度以上细胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴细胞耗竭：T淋巴细胞功能下降，外周血淋巴细胞显着减少，CD4<200/μl，CD4/CD8<1.0，（正常人为1.25～2.1），迟发型变态反应皮试阴性，有丝分裂原刺激反应低下。 （2）B淋巴细胞功能失调：多克隆性高球蛋白血症，循环免疫复合物形成和自身抗体形成。 （3）NK细胞活性下降 （4）各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤，如KS； （三）HIV抗体检测 1.酶联免疫吸附法（ELISA）；2.明胶颗粒凝集试验（PA）；3.免疫荧光检测法（IFA）；4.免疫印迹检测法（Western Blot，简称WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。其中前三项常用于筛选试验，后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体，95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者，此时有必要检测HIV病毒。 （四）PCR技术检测HIV病毒 1．标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本，分成两份，其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20～-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖（Ficoll）离心分离，收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。 可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞（PMC）： ① 取4ml血液用Hanks液1：1稀释。 ② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液，勿搅乱分层。 ③ 2500r/min离心20min。 ④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层，再用Hanks液洗两遍。 ⑤ 加入RPMI-1640生长液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P）,使细胞浓度为2×106/ml。 ⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2～3d，作为HIV分离的靶细胞。 2．模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法，但其基本原理大致相同，使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。 （1）从外周血单核细胞中提取DNA 方法A： ①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。 ②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。 ③2500r/min离心10min，弃上清。 ④沉淀的细胞用PBS洗两次，最后将细胞悬浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.3）中，使细胞浓度为6×106/ml。 ⑤加入等体积的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。 ⑥　于37℃保湿后置冰箱保存。 该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。 方法B： ①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。 ②2500r/min离心10min，收集沉淀的细胞，上清液可作血清学研究用。 ③用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖）将沉淀的细胞洗一次。 ④再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗两次。 ⑤通过聚蔗糖-400离心，分离单核细胞。 ⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100μg/ml蛋白酶K）中使细胞裂解。 ⑦用酚一氯仿抽提两次，将水相转移到一支新的离心管内。 ⑧加入3倍体积的无水乙醇，于-20℃放置20min，13000r/min离心10min，弃上清，沉淀物经真空干燥后，用100μl蒸H2O溶解，于-20℃保存。 该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。 （2）从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录 方法A： ① 5ml血液标本，通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。 ② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。 ③ 2500r/min离心20min，收集沉积细胞。 ④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使细胞浓度为104/ml。 ⑤ 13000r/min，于4℃离心10min，收集上清液。 ⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内，立即置-80℃保存，备用。 在RNA反转录前，先将RNA样品用DNase处理，除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如（7）～（9）。 ⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。 ⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。 ⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase A（15μg/份），37℃保温10min，置-20℃保存。 方法B： ①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。 ②40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。 ③将沉淀物溶于变性液（4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇）中充分混匀. ④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min. ⑤13000r/min离心20min. ⑥轻轻将水相转移到一支新管中. ⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右. ⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀. ⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥. ⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录. ⑾ 取10μl RNA样品. ⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。 ⒀ 42℃保温30～60min,然后93℃5min. ⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。 由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。 [b]二、PCR扩增步骤[/b] （一）引物的设计与合成 HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式-PCR方法，来提高检测的灵敏性。 检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。 已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。 表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针

引物及探针	序列（5′3′）	基 因区	片段（bp）
SK38	ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT	gag	115(HIV1)
SK39	TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19(P)	ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145	AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT	gag	141(HIV1)
SK101	GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC		139(HIV2)
SK102(P)	GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145	AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT	gag	142(HIV1)
SK150	TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC		139(HIV2)
SK102(P)	GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O-1	GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC	gag	525(HIV1)
O-2	TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I-2	TTGGTCCTTGTCTTATGTCC	gag	422(HIV1)
I-1	TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55	CCTGCTATGTCACTTCCCCT	gag	190(HIV1)
GK56	TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P-1	TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT	pol	355(HIV1)
P-2	TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29	ACTAGGGAACCCACTGCT	Itr	105(HIV1)
SK30	GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31(P)	ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13	TGGCGCCCGAACAGGGAC	LTR	168
P14	TACCCACGCTCTCGCAG
SK89	AGGAGCTGGTGGGGAACG	LTR	165(HIV2)
SK90	GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91(P)	TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68	AGCAGCAGGAAGCACTATGG	env	142(HIV1)
SK69	CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70(P)	ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1	ACAATTATTGTCTGGTATAG	env	135(HIV1)
CO2	AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3(P)	TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71	TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA	env	320(HIV1)
CO72	TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75(P)	GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA

（二）PCR扩增步骤 1．扩增条件 当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0.5～1.0mmol/ldNTP,每100μl反应体积2～4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25～30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。 2.扩增的步骤 (1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。 (2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl[XB]2[/XB],16mmol/LDTT)。 (3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。 (4)反应混合物于93℃变性处理7min。 (5)冷却至室温,加入4UTaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。 (6)加入50μl矿物油,离心10s。 (7)置70℃保温5min。 (8)PCR扩增25个循环,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。 PCR检测出现假阴性的原因有：标本中的HIV-DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV-DNA。 [b]三、扩增产物的检测和分析[/b] 扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳，限制性内切酶图谱，DNA序列分析及分子杂交等技术。 （一）凝胶电泳分析 根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。 （二）分子杂交分析 分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下： PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。 PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。 [b]四、PCR技术在HIV检测中的应用[/b] PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长潜伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。 （一）血清抗体阳性病人HIV序列的检测 有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物，精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。 从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100%检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64%，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的异源性，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99%）。 (二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测 由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月.对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24～39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。 (三)新生儿HIV序列的检测 HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%～60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30～50%的这些新生儿可在母亲的子宫里,在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何症状.病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药毒性大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12～15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的. PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群，如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿，阳性患者的性伴侣，静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。 [b]五、艾滋病诊断标准：[/b] 1．艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。 （1）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续发热达38℃一个月以上； （2）近期内（3-6个月）体重减轻10%以上，且持续腹泻（每日达3-5次）一个月以上。 （3）卡氏肺囊虫肺炎（PCR） （4）卡波济肉瘤KS。 （5）明显的霉菌或其他条件致病感染。 2．若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时，可为实验确诊艾滋病病人。 （1）CD4/CD8（辅助/抑制）淋巴细胞计数比值<1，CD4细胞计数下降； （2）全身淋巴结肿大； （3）明显的中枢神经系统占位性病变的症状和体征，出现痴呆，辩别能力丧失，或运动神经功能障碍。