第六节 诊断

[b]一、诊断依据:[/b] (一)流行病学及临床表现 (二) 实验室检查 (1)主要是中度以上细胞免疫缺陷包括:CD4+T 淋巴细胞耗竭:T淋巴细胞功能下降,外周血淋巴细胞显着减少,CD4<200/μl,CD4/CD8<1.0,(正常人为1.25~2.1),迟发型变态反应皮试阴性,有丝分裂原刺激反应低下。 (2)B淋巴细胞功能失调:多克隆性高球蛋白血症,循环免疫复合物形成和自身抗体形成。 (3)NK细胞活性下降 (4)各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤,如KS; (三)HIV抗体检测 1.酶联免疫吸附法(ELISA);2.明胶颗粒凝集试验(PA);3.免疫荧光检测法(IFA);4.免疫印迹检测法(Western Blot,简称WB法);5.放射免疫沉淀法(RIP)。其中前三项常用于筛选试验,后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体,95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者,此时有必要检测HIV病毒。 (四)PCR技术检测HIV病毒 1.标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本,分成两份,其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20~-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖(Ficoll)离心分离,收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。 可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞(PMC): ① 取4ml血液用Hanks液1:1稀释。 ② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液,勿搅乱分层。 ③ 2500r/min离心20min。 ④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层,再用Hanks液洗两遍。 ⑤ 加入RPMI-1640生长液(10%胎牛血清,10%白介素-2,2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P),使细胞浓度为2×106/ml。 ⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2~3d,作为HIV分离的靶细胞。 2.模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法,但其基本原理大致相同,使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。 (1)从外周血单核细胞中提取DNA 方法A: ①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。 ②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。 ③2500r/min离心10min,弃上清。 ④沉淀的细胞用PBS洗两次,最后将细胞悬浮在溶液A(100mmol/KCl,10mmol/LTris-HCl,pH8.3)中,使细胞浓度为6×106/ml。 ⑤加入等体积的溶液B(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,2.5mmol/l MgCl2,10%Tween20,10%NP-40)。 ⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。 该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。 方法B: ①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。 ②2500r/min离心10min,收集沉淀的细胞,上清液可作血清学研究用。 ③用10ml0.9%NaCl(含50%葡萄糖)将沉淀的细胞洗一次。 ④再用10ml 0.9%NaCl(含50%葡萄糖)洗两次。 ⑤通过聚蔗糖-400离心,分离单核细胞。 ⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液(10mmol/L,Tris-HCl pH8.3,10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,0.5%SDS,100μg/ml蛋白酶K)中使细胞裂解。 ⑦用酚一氯仿抽提两次,将水相转移到一支新的离心管内。 ⑧加入3倍体积的无水乙醇,于-20℃放置20min,13000r/min离心10min,弃上清,沉淀物经真空干燥后,用100μl蒸H2O溶解,于-20℃保存。 该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。 (2)从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录 方法A: ① 5ml血液标本,通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。 ② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。 ③ 2500r/min离心20min,收集沉积细胞。 ④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液(0.4mmol/L NaCl,10mmol/l Tris-HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40)中,使细胞浓度为104/ml。 ⑤ 13000r/min,于4℃离心10min,收集上清液。 ⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内,立即置-80℃保存,备用。 在RNA反转录前,先将RNA样品用DNase处理,除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如(7)~(9)。 ⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。 ⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。 ⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品,加入RNase A(15μg/份),37℃保温10min,置-20℃保存。 方法B: ①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。 ②40000r/min,4℃离心10min,收集沉淀。 ③将沉淀物溶于变性液(4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇)中充分混匀. ④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min. ⑤13000r/min离心20min. ⑥轻轻将水相转移到一支新管中. ⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右. ⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀. ⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥. ⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录. ⑾ 取10μl RNA样品. ⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl,10mmol/L Tris - HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。 ⒀ 42℃保温30~60min,然后93℃5min. ⒁ 立即置冰浴中冷却,备用。 由上述方法制得的RNA反转录样品,通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。 [b]二、PCR扩增步骤[/b] (一)引物的设计与合成 HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异,因而引物应在保守区内设计,一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计,HIV感染的细胞往往很少,要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞,PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力,同时一般要采用巢式-PCR方法,来提高检测的灵敏性。 检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照,进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析,进一步确定扩增产物的特异性。 已经被确定的保守区是gag,tat,evn,pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前,要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的,它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板,就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段,那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进,看是否能改善其特异性,否则要另选引物。 表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针
引物及探针序列(5′3′)基 因区片段(bp)
SK38ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAATgag115(HIV1)
SK39TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19(P)ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag141(HIV1)
SK101GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC139(HIV2)
SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag142(HIV1)
SK150TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC139(HIV2)
SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O-1GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACgag525(HIV1)
O-2TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I-2TTGGTCCTTGTCTTATGTCCgag422(HIV1)
I-1TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55CCTGCTATGTCACTTCCCCTgag190(HIV1)
GK56TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P-1TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCATpol355(HIV1)
P-2TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29ACTAGGGAACCCACTGCTItr105(HIV1)
SK30GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31(P)ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13TGGCGCCCGAACAGGGACLTR168
P14TACCCACGCTCTCGCAG
SK89AGGAGCTGGTGGGGAACGLTR165(HIV2)
SK90GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91(P)TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68AGCAGCAGGAAGCACTATGGenv142(HIV1)
SK69CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70(P)ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1ACAATTATTGTCTGGTATAGenv135(HIV1)
CO2AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3(P)TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAAenv320(HIV1)
CO72TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75(P)GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA
(二)PCR扩增步骤 1.扩增条件 当选择的引物影响其特异性和扩增效果时,首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度,PCR循环数,反应物浓度等。扩增的条件通常是1~4mmol/LMgCl2,0.5~1.0mmol/ldNTP,每100μl反应体积2~4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25~30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37~55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。 2.扩增的步骤 (1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。 (2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl,2mmol/L MgCl[XB]2[/XB],16mmol/LDTT)。 (3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。 (4)反应混合物于93℃变性处理7min。 (5)冷却至室温,加入4UTaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。 (6)加入50μl矿物油,离心10s。 (7)置70℃保温5min。 (8)PCR扩增25个循环,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。 PCR检测出现假阴性的原因有:标本中的HIV-DNA量极少,未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平;DNA模板和PCR产物未能完全变性,使得引物不能或较少与DNA片段结合,从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异,也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有:标本的交叉污染;重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照,阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液,阳性对照用已知的HIV-DNA。 [b]三、扩增产物的检测和分析[/b] 扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳,限制性内切酶图谱,DNA序列分析及分子杂交等技术。 (一)凝胶电泳分析 根据所采用的引物对之间DNA片段的长度,预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较,可初步判断PCR产物的特异性,然后将产物用限制性内切酶水解,进一步确定扩增产物的特异性。 (二)分子杂交分析 分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法,也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交,检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下: PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。 PCR技术检测HIV具有敏感性高,特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。 [b]四、PCR技术在HIV检测中的应用[/b] PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列,这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性;可用来监测长潜伏期(4~7年)病人,以及在抗病毒治疗期间病毒的水平;也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6~9个月期间,他们的血液中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。 (一)血清抗体阳性病人HIV序列的检测 有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物,精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明,在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者,实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。 从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA,用PCR可100%检出病毒序列;用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本,经PCR扩增检出病毒序列者为64%,血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性,表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的异源性,为提高检测的阳性率可采用多种引物(如LTR,gag和env基因的引物)。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性(99%)。 (二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测 由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月.对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24~39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。 (三)新生儿HIV序列的检测 HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%~60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30~50%的这些新生儿可在母亲的子宫里,在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何症状.病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药毒性大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12~15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的. PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群,如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿,阳性患者的性伴侣,静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。 [b]五、艾滋病诊断标准:[/b] 1.艾滋病病毒抗体阳性,又具有下述任何一项者,可为实验确诊艾滋病病人。 (1)近期内(3-6个月)体重减轻10%以上,且持续发热达38℃一个月以上; (2)近期内(3-6个月)体重减轻10%以上,且持续腹泻(每日达3-5次)一个月以上。 (3)卡氏肺囊虫肺炎(PCR) (4)卡波济肉瘤KS。 (5)明显的霉菌或其他条件致病感染。 2.若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时,可为实验确诊艾滋病病人。 (1)CD4/CD8(辅助/抑制)淋巴细胞计数比值<1,CD4细胞计数下降; (2)全身淋巴结肿大; (3)明显的中枢神经系统占位性病变的症状和体征,出现痴呆,辩别能力丧失,或运动神经功能障碍。