三、基因诊断技术检测梅毒螺旋体

梅毒螺旋体不能进行体外培养。检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋体常用的标准方法。然而用RIT对新生儿或成人梅毒进行常规诊断不切合实际。梅毒的血清学诊断对确定感染及治疗很有意义，但对早期梅毒诊断不敏感，对先天性及神经性梅毒的诊断不够特异。血清学试验用作先天性梅毒的辅助诊断，其首要问题是将无症状感染婴儿从非感染婴儿区别开来，这些婴儿的母亲梅毒血清试验阳性，困难在于不能将母亲体液免疫反应同婴儿的抗体反应相区别，因为母亲的IgG可传递给胎儿。另外由于IgG终身存在，所以很难评价治疗结果。血清学诊断常常又存在着假阳性。 PCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。 （一）PCR引物的设计部位与序列： 目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统：扩增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），扩增39KDa碱性膜蛋白基因（bmp基因），扩增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和扩增tmpA基因。 三种扩增系统的引物序列： 47-1CACAATGCTCACTGAGGATAGT648-669 47-2ACGCACAGAACCGAATTCCTTG1284-1035 Tpp47-3　TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC713-734 47-4TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT　 1187-1208 TP3　CAGGTAACGGATGCTGAGT　256-275 TP4　CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741 bmpTP5（探针） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519 TP7　CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191 TP8　AACGCCTCCATCGTCACACC　788-769 F1　 CTCTTCAAGGAGCTCAT222-206 Tpf-1F2　 AGACAGTGGTTATGCTc 　 77-61 或tyf-1F3(探针)ATTGCGCCAGCATGTAG　 114-130 F4（探针）ATTGCGCCGGCATGTAG　 114-130 （二）操作方法 1．采集标本，根据病人的情况可采取局部分泌物，抽取淋巴结液，羊水，血清，脑脊液。用适量的蒸馏水稀释，保存于4℃冰箱。 2．标本处理：目的是为了暴露梅毒螺旋体的DNA，消除标本对PCR的抑制物。采用下列处理方法。 ①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量离心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷却，13000g离心10s，上清用作PCR分析。 ②低速离心法：将100μl羊水，血清或脑脊液加入到900μl无菌磷酸缓冲液中，10000g室温离心10min，上清转入另外的微量离心管中，20000g4℃离心1h，弃上清，沉淀悬浮于50μl 无菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷却，取40μl上清作PCR。 ③碱裂解法：取收集标本100μl加于含1mol/lNaCl,1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min,用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl(pH8.0)中和。用相同体积的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整个600μl的溶液用相同体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，然后用相同体积的异丙醇沉淀（-20℃过液）。13000g4℃离心15min，轻轻倒出上清，凉干。沿淀悬浮于51μl无菌水中，取20μl作PCR模板。 （三）PCR扩增 1．扩增47KDa膜抗原基因:100ml反应物含：10mmol/l TrisHCl(pH8.3),50mmol/L KCl，3mmol/LMgCl2,100μg/ml明胶，0.5μg引物(47-1和47-2),75mmol/LdNTPs,2.5u TaqDNA聚合酶。取不同量各种制备的DNA作模板,反应过程:94℃15s，60℃1min,72℃1min,循环40次,末次循环增加72℃10min延伸时间,取10ml反应物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。点杂交分析产物：取10mlPCR扩增产物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中变性10min,用380μ11.5mol/l NaCl-1mmol/L Tris(pH7.2)中和,然后用Minifold I点膜,80℃真空处理膜2h,用496bp探针65℃杂交过夜。探针为引物47-3和47-4的PCR产物,用随机引物法标记. 2．扩增39KDa碱性膜蛋白基因:25μ1反应体系含:1×RT缓冲液,50mmol/lTris-HCl(pH8.5),50mmol/LNaCl,4mmol/LMgCl2,2mmol/L DTT(二硫基苏糖醇),200μmol/l dNTP,100μmol/L引物(TP7和TP8)，0.01%牛血清白蛋白(无DNase和RNase),1UTaqDNA聚合酶,5μ1样品,可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增强PCR。 PCR1:先用引物TP7和TP8扩增出617bp片段,反应过程:94℃3min后进入循环过程:94℃1min,65℃1min,72℃1min,循环数为30或35,每一循环中72℃延伸递增5s,最后一次延伸时间延长到6min. PCR2:再用巢居引物TP3和TP4扩增出500bp片段,PCR1产物用蒸馏水稀释10倍,取5μ1用作第二次扩增.PCR2中MgCl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4),其它条件与PCR1相同。 PCR产物分析。①取10μ1反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳；②Southern印迹后,用寡核苷酸探针TP5(以32P作末端标记)杂交。 3．扩增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因:100μ1反应物含:50mmol/l KCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2,0.2mg/ml明胶,1μmol/ldNTP,2mmol/L引物(F1和F2),2.5UTaqDNA聚合酶,10μ1经处理的兔睾丸梅毒螺旋体悬液,反应过程:94℃1min,55℃ 1.5min,72℃ 2.5min,循环40次，取10μ1PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹后,用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异物的探针F4分别杂交。 为使扩增效率达到最大，反应参数应选择最佳数值。使用大片段双股DNA探针检测PCR产物，而不用合成的寡核苷酸探针,因为这样可通过标记得到较高、特异的放射活性。另外，大片段探针能最大减少野生株tpp47可变序列的假阴性结果及由于Taq DNA聚合酶的错误导致碱基替代的假阴性结果。实验证实：PCR的敏感性确能达到检测单一tpp47拷贝的水平。 由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的。尽管大量数椐支持47Da膜抗原基因及其相应基因具梅毒螺旋体特异性，还应深入研究该方法的特异性。在EB染色的琼脂糖凝胶偶而可见非特异的PCR产物，（如扩增淋病奈氏球菌）时就需要用tpp47特异的探针杂交来增加特异性及敏感性。仅从梅毒螺旋体梅毒亚种和雅司亚种染色体DNA获得了特异的PCR产物，表明了病原性螺旋体非常相近的亲缘关系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。扩增tpp47不能如常规法那样能区分梅毒螺旋体和伯氏疏螺旋体，在用血清学试验诊断梅毒和莱姆疾病时，这两种螺旋体有交叉反应。 梅毒螺旋体梅毒亚种tpf-1基因在123位置为A，雅司亚种tpf-1基因在123位置为G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特异的寡核苷酸探针（两种探针仅一个核苷酸不同）检测不同菌株tpf-1或tpf-1基因的扩增产物。结果表明：不能根据tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同来区别梅毒亚种。这些菌种从梅毒患者分离，一些已用兔传代多次，通过对新鲜临床标本中梅毒螺旋体DNA的分析比较，以上结果可能是由于梅毒螺旋体在传代中点突变所致。