五、实验室检查

淋球菌实验室检查包括涂片，培养检查淋球菌、抗原检测，药敏试验及PPNG测定，基因诊断。 （一）涂片检查： 取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，作革兰氏染色，在多形核白细胞内找到革兰氏阴性 双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90%左右，可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60%，且有假阳性，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少，阳性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高检出率。 咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病，因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。 （二）培养检查： 淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，只要培养阳性就可确诊，在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin（TM）培养基和New York City（NYC）培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基，均含有抗生素，可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃，70%湿度，含5%-10%CO2（烛缸）环境中培养，24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态，革兰氏染色，氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%，女性80-90%。 （三）抗原检测 1．固相酶免疫试验（EIA）：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用，可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。 2．直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免 疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高，特异性差，加之实验人员的判断水平，故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。 （四）基因诊断 1．淋球菌的基因探针诊断 淋球菌的基因探针诊断，所用的探针有：质粒DNA探针，染色体基因探针和rRNA基因探针。 （1）质粒DNA探针 ① 隐蔽质粒DNA探针，淋球菌质粒分为三种：接合性质粒，分子最大，为36kb DNA；　耐药性质粒包括两个质粒，DNA长分别为5.6kb和7.1kb；隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中，其它奈瑟菌不含有此质粒，故可用它的序列作为特异DNA探针检测淋球菌。Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌，所用探针为隐蔽质粒。用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测，有124株淋球菌杂交反应阳性，占93%，还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应，对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌。研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中（包括不含该质粒的菌株）。因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本，采用非放射性地高辛标记系统，其敏感性和特异性分别为95%和98%。 ② 耐药性质粒DNA探针 淋球菌的抗药质粒可分为：①产青毒素酶淋球菌（PPNG）其β-内酰胺酶阳性；②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌（TRNG）。 PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的，该菌中含有编码产青毒酶的基因，该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中，而后者居多，称之为产青毒素酶质粒，质粒有二种，大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针，采用酶化学发光法标记，液相杂交，用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株虽对四环素耐药，但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此，在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。 (2)染色体探针 染色体探针包括已知功能的基因探针，如菌毛DNA探针和paI基因探针，这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用；未知功能的基因探针，这些探针序列与染色体的特定序列互补，但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低，检测灵敏度较低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。 （3）rRNA基因探针 rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针，该探针的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探针的特点是：①可以增加探针检测的灵敏度，rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子；②rRNA具有进化上的保守性；③杂交方法简便、快速；④由于rRNA的含量较高，标本不需增菌。美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACe C，是以rRNA 及其基因为检测靶序列，采用放射性标记，在2h内可以完成检测，Peter用这种探针检测395个临床标本，结果灵敏度和特异性分别为92.9%，99.4%，他认为PACeC系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者，这是目前培养难于达到的。 2、淋球菌的基因扩增检测 上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法，虽然比培养方法在灵敏度，特异性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高，PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性，它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床标本中极微量的病原体。 （1）淋球菌DNA的提取 ①培养菌的DNA提取 将培养得到的淋球菌，以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解，裂解液组成为：1m NaCl 1MNaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。将裂解液混匀后煮沸1min，然后用100μl 的1MTris pH7.0中和碱性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，提取的DNA溶于30μl蒸馏水或TE缓冲液中。 ②临床棉拭子标本的提取 将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min，以便将标本尽量溶于溶液中，将棉拭子弃去，悬浮液于2-3000r/min离心5min，吸去上清液，细胞重新溶于100μl 1×PCR缓冲液，其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml，细胞悬浮液于50-60℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K,12000r/min离心10min,上清液含DNA模板。 （2）PCR引物的设计 由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在，同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒，因此很多PCR引物设计在CPPB基因区。 靶基因　 引物序列 片段长度（bp） CPPB NG1 5′GTT TGG CTGGTT GAT TCA AG 3′633 NG2 5′GCA AGA TTTCCG ATTT GGC G 3′ CPPB HO15′GCT ACG CATACC CGC GTT GC 3′ 390 HO2 5′CGA AGA CCTTCG AGC AGA CA 3′ rRNA引物15′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′　 206 引物2 5′-ACA CTC GAGTCA CCC AGT TC-3′ CPPB GC15′CTT ATC GTTTGG CTG GTT GAT TC 3′ 435 GC2 5′ACC AAG ACCAAA GGT TTG ACA CTG 3′ GC3　5′ATT TTC CAGTGT CAA AC 3′ 241 GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′ （3）PCR扩增 取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反应液中，最终PCR反应液中含dNTP各100μmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L,加无菌石蜡油30μl，1000r/min离心30s，进行PCR扩增循环，反应条件：94℃变性1min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min。共30个循环，最后72℃延伸5min。 扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min，溴化乙锭染色，紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带，分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致。 （4）PCR的灵敏性和特异性 由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒，因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性，实验证明，一般传统一步PCR（GC1-GC2）方法可以检出3个淋球菌，而用单管巢式PCR（GC2-GC4）可以检出≤0.3淋球菌（9个CPPB基因）。这些引物经特异性实验，只能扩增淋球菌的DNA，而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。 （5）单管巢式PCR方法 是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物（GC1，GC2）为25b退火温度比较高（68℃），巢式内侧两个引物GC3-GC4为17b退火温度较低（46℃），PCR反应液的其它成分与一般PCR相同。这样，通过控制退火温度（68℃）使外侧引物先行扩增，经过20-30次循环后（第一次PCR），再降低退火温度（46℃）使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增，该PCR的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌。 （6）淋球菌连接酶链反应（LCP）检测方法 目前PCR检测淋球菌的方法被广泛地使用。其特异性，灵敏性不断提高。同时另一种基因诊断技术——连接酶链反应（LCP）也以其高特异，高灵敏性被应用于淋球菌的检测中。LCp 与PCR不同之处在于LCp 用四对引物，所用酶是连接酶。连接酶可以将两条相邻引物连接起来。连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板，后者在连接酶作用下连接，又可作为模板，如此进行30-40次循环。LCP所用的模板处理方法与PCR模板制备相等。LCP所用的探针除了可以设计在CPPB基因上，也可以设计在染色体基因序列上，例如opa-1基因。美国Abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个LCP探针，由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复。因此，该组LCP探针具有高灵敏性和特异性。LCP反应过程： 将模板加入LCP反应液中，LCP反应液：20mmol/L Tris-HClpH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EDTA; 10mmol/L NAD+;10mmol/L DTT,有标记物的两个相邻探针各40fmol/L，未标记的探针各40fmol/L，15U耐热连接酶，反应条件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循环。100μl反应产物加入酶标板微孔中，进行显色反应，最后用酶标仪读取光值。根据Buimer的实验证明，LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%，尿液标本为88.9%，女性宫颈棉拭子标本为95.4%。LCP方法的特异性高达100%，这一点明显高于PCR的特异性，避免了假阳性的发生。 3． 临床基因诊断淋球菌的注意事项 目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用PCR方法，但是该方法在临床检测中应注意几个问题。 （1）引物设计 除了以上所列的淋球菌PCR引物外，还可从在其它基因上设计，但 是引物序列应具有特异性。因为细菌的染色体较大，许多基因序列并没有搞清楚；同时细菌之间或近或远有一定的同源性，而且细菌所含质粒序列间也存在同源性，因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析，同时进行特异性和灵敏性实验，从中选择引物进行临床检测。 （2）临床标本处理 对临床标本来讲，PCR模板要求越纯越好。这就要求在采集标本时要取到准确的位置，对于无症状患者要适当多采样，以保证采集到病原体细菌。另外由于临床标本成分比较复杂，有时简单处理的标本PCR扩增效果并不理想，这可能是由于杂质过多造成的,需要进一步纯化，如用酚一氯仿抽提法纯化，结果将会好转。这种纯化方法比较麻烦,目前已有商品化的DNA纯化试剂盒,可以较简便地从临床标本中提取高纯度的DNA。 （3）PCR产物的检测方法　不久以前临床PCR检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行PCR产物的鉴定。该方法存在许多问题，如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果。目前用杂交显色法代替电泳法，提高了结果判断的特异性和灵敏性。 总之，PCR方法与LCP方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高，时间也大大缩短。随着基因诊断技术的不断改进。PCR方法与LCP方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法。 （五）药敏试验：在培养阳性后进一步作药敏试验。用纸片扩散法做敏感试验，或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），用以指导选用抗生素。 （六）PPNG检测：β-内酰胺酶，用纸片酸度定量法，使用Whatman I号滤纸PP-NG 菌株能使其颜色由蓝变黄，阳性为PPNG，阴性为N-PPNG。