（四）免疫细胞化学术

免疫细胞化学（immunocytochemistry）术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫细胞化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多，具有抗原性。分离纯化人或动物组织某种蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，后者即产生相应的特异性抗体（免疫球蛋白）。从被免疫动物的血清中提取出该抗体，再以荧光素、酶、铁蛋白或胶体金标记，用这种标记抗体处理组织切片或细胞，标记抗体即与细胞的相应蛋白质（抗原）发生特异性结合（图1-4)。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物（图1－5）。常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,从辣根菜中提取的），它的底物是3，3[SB]'[/SB]－二氨基、联苯胺（DAB）和H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB],HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察（图1－6）。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合，也可在光镜和电镜下观察（图1－7）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue006.jpg[alt]大鼠腺垂体免疫组织化学（PAS法）示生长激素细胞 [/alt][/img] 图1－6 大鼠腺垂体免疫组织化学（PAS法）示生长激素细胞 （上海医科大赵培林教授供图） [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue007.jpg[alt]免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体 [/alt][/img] 图1-7 免疫细胞化学（蛋白A-胶体金法）和原位杂交术示大鼠垂体 催乳素细胞电镜像 N催乳素细胞核 ↑分泌颗粒内显示金粒 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue008.gif[alt]粗面内质网（RER）显示银粒 [/alt][/img] 粗面内质网（RER）显示银粒 （加拿大Douglas医院研究中心童毅爱博士赠图） 标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法，即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合（图1－8）。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原一抗－标记二抗复合物（图1－8）。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。间接法中较常用的是一种称之为过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法），该法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合，因此敏感性很强（图1－9）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue009.jpg[alt] 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图[/alt][/img] 图1－8 免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue010.jpg[alt] 免疫细胞化学PAP法示意图[/alt][/img] 图1－9 免疫细胞化学PAP法示意图 免疫细胞化学术近10年来又有新进展，如生物素－亲合素等新颖试剂的应用，为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素－亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素－生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性（图1－10）。②桥连亲合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果（图1－10）。③亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素－生物素－过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度（图1－10）。现有配制现成的ABC药盒商品供应，操作简便，是目前广泛应用的一种方法。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/zuzhixueyupeitaixue/zuzhixueyupeitaixue011.jpg[alt]生物素－亲合素免疫细胞化学示意图 [/alt][/img] 图1－10 生物素－亲合素免疫细胞化学示意图 （1）标记亲合素－生物素法 （2）桥连亲合素－生物素法 （3）亲合素－生物素－过氧化物酶复合物法（ABC法）