五、常用贮存液的配制

[b]1．30%丙烯酰胺溶液[/b] 【配制方法】 将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。 【注意】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。 一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。 在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。 [b]2．40%丙烯酰胺[/b] 【配制方法】 把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。 【注意】 见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。 [b]3．放线菌素D溶液[/b] 【配制方法】 把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD[SB]440[/SB]值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。 【注意】 放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。 药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。 [b]4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液[/b] 【配制方法】 在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃ [b]5．10mol/L乙酸酰溶液[/b] 【配制方法】 把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 [b]6．10%过硫酸铵溶液[/b] 【配制方法】 把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。 [b]7．BCIP溶液[/b] 【配制方法】 把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ [b]8．2×BES缓冲盐溶液[/b] 【配制方法】 用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na[XB]2[/XB]HPO[XB]4[/XB]，室温下用HCl调节　该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于-20℃。 [b]9．1mol/L CaCl[XB]2[/XB]溶液[/b] 【配制方法】 在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl[XB]2[/XB]·6H[XB]2[/XB]O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。 【注意】 制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。 [b]10．2.5mol/L CaCl[XB]2[/XB]溶液[/b] 【配制方法】 在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl[XB]2[/XB]·6H[XB]2[/XB]O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 [b]11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液[/b] 【配制方法】 用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。 【注意】 DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。 [b]12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液[/b] 【配制方法】 把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节　每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。

碱基	波长（nm）	消化系数（ε）[L/（mol·cm）]
A	259	1.54×10[SB]4[/SB]
G	253	1.37×10[SB]4[/SB]
C	271	9.10×10[SB]3[/SB]
T	260	7.40×10[SB]3[/SB]

比色杯光径为1cm时,吸光度=εM [b]13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H[XB]2[/XB]O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节　溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。 【注意】 EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。 [b]14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）[/b] 【配制方法】 在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。 【注意】 小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。 [b]15．2×HEPES缓冲盐溶液[/b] 【配制方法】 用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB]·2H[XB]2[/XB]O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH调节　pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。 [b]16．IPTG溶液[/b] 【配制方法】 IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 [b]17．1mol/L乙酸镁溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。 [b]18．1mol/L MgCl[XB]2[/XB]溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解203.4gMgCl[XB]2[/XB]·6H[XB]2[/XB]O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。 【注意】 MgCl[XB]2[/XB]极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。 [b]19．β-巯基乙醇（BME）溶液[/b] 【配制方法】 一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4℃。 【注意】 BME或含有BME的溶液不能高压处理。 [b]20．NBT溶液[/b] 【配制方法】 把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃。 [b]21．酚/氯仿溶液[/b] 【配制方法】 把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris·HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris·HCl(pH7.6)液层，保存于4℃。 【注意】 酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。 [b]22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液[/b] 【配制方法】 用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。 【注意】 PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。 PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节　为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。 [b]23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液[/b] 【配制方法】 在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na[XB]2[/XB]HPO[XB]4[/XB]和0.24g KH[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB],用HCl调节　溶液的pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in[SB]2[/SB](1034×10[SB]5[/SB]Pa)高压下蒸气灭菌20min。保存于室温。 [b]24．1mol/L乙酸钾（pH7.5）溶液[/b] 【配制方法】 将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调节　pH值至7.5后加入纯水定容到1L，保存于-20℃。 [b]25．乙酸钾溶液（用于碱裂解）[/b] 【配制方法】 在60ml 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。 [b]26．3mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液[/b] 【配制方法】 在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节　pH值至5.2或用稀乙酸调节　pH值至7.0，加水定容到1L，分装后高压灭菌。 [b]27．5mol/L NaCl溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。 [b]28．10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液[/b] 【配制方法】 在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节　溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。 【注意】 SDS的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。 [b]29．20×SSC溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaOH溶液调节　pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 [b]30．20×SSPE溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6g NaH[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB]·H[XB]2[/XB]O和7.4g EDTA，用NaOH溶液调节　pH值至7.4（约需6.5ml 10ml/L NaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。 [b]31．100%三氯乙酸溶液[/b] 【配制方法】 在装有500g TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（M/V）TCA。 [b]32．1mol/L Tris溶液[/b] 【配制方法】 在800ml水中溶解121.91gTris碱，加入浓HCl调节　pH值至所需值。 pH　HCl 7.4 70ml 7.6 60ml 8.0 42ml 应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 【注意】 如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。 尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris溶液的pH值，但仍可向大多数厂商购得合适的电极。 Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。例如：0.05mol/L的溶液在5℃、25℃、和37℃时的pH值分别为9.5、8.9和8.6。 [b]33．Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/l Tris）[/b] 【配制方法】 在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034×10[SB]5[/SB]Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保存。 [b]34．X-gal溶液[/b] 【配制方法】 X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。 [b]杂交试验中用于降低背景的封闭剂[/b]

试剂	用途
Denhardt试剂	Northern杂交
	使用RNA探针的杂交
	单拷贝序列的Southern杂交
	将DNA固定于尼龙膜上的杂交
Denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μg/ml经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC或6×SSPE）中。50×Denhardt液中含5g聚蔗糖（Ficoll,400型，Pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500ml。
BLOTTO	Grunstein-Hogness杂交
	Benton-Davis杂交
	除单拷贝序列Southern杂交以外的所有Southern杂交
	斑点印迹
1×BLOTT（牛乳转移技术优化液，Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。BLOTTO不应与高浓度的SDS并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入NP-40至终浓度为1%。BLOTTO不能用作Northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有RNA酶，其活性之高使人无法接受。
注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。
肝素	Southern杂交
	原位杂交
肝素（Sigma H-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用4×SSPE或4×SSC溶解配制成50mg/ml的浓度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。
经变性并被打断的鲑精DNA	southern和Northern杂交
把鲑鱼精子DNA（Sigma,Ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中NaCl的浓度调至0.1mol/L，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合DNA溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切DNA。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀DNA。离心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的OD[XB]260[/XB]值并计算出精确的DNA浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子DNA