六、杂交前处理
[b]1．蛋白酶[/b]（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：
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精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20℃存放，用时再取出冻融，余者弃去。
（2）工作液（临用前配）：
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取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。
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（3）关于P-K缓冲液的配制：
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称取上述试剂，充分混合即可。
②1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：
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先将Tris于800ml ddH[XB]2[/XB]O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH[XB]2[/XB]O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。
③0.5mol/L的EDTA：
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称取EDTA溶于约600ml ddH[XB]2[/XB]O中，常需60℃持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH[XB]2[/XB]O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。
[b]2．甘氨酸[/b]
（1）1mol/L甘氨酸：
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan162.jpg[alt] 1mol/L甘氨酸[/alt][/img]
称取甘氨酸75g溶于ddH[XB]2[/XB]O或DEPC水中，最后补足ddH[XB]2[/XB]O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。
（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan163.jpg[alt]甘氨酸工作液（0.1mol/L） [/alt][/img]
将二者按1：10比例稀释，即得甘氨酸工作液。一般要求临用前新鲜配制。
甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化。
[b]3．0.25%醋酸-0.25%醋酸酐[/b]
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan164.jpg[alt]0.25%醋酸-0.25%醋酸酐 [/alt][/img]
配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及浓HCl。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。
生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。
[b]4．RNA酶溶液[/b]
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan165.jpg[alt] RNA酶溶液[/alt][/img]
取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20℃储存。
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临用前，取RNA酶A储备液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.
5.0.2%
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取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。
